[发明专利]重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法

摘要

本发明公开一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业化生产的重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法，按照如下步骤进行：提取新鲜红鳍东方鲀肾脏总RNA并反转录进行第一链的cDNA的合成；以上述第一链的cDNA为模版进行RT-PCR扩增，上游引物NcoⅠ：5’-CATGCCATGGGCTCCTACATCCCAGTAGAAATG-3’；下游引物XhoⅠ：5’-CCGCTCGAGATGACCTCGAATCGACATCT-3’；建立克隆载体、表达载体、转化入表达菌内，培养菌株得到菌种；将所收集的菌种进行扩大培养，经IPTG诱导后收集菌体；将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。

主权项

一种重组红鳍东方鲀干扰素γ蛋白的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：a. 提取新鲜红鳍东方鲀肾脏总RNA并反转录进行第一链的cDNA的合成；b．以上述第一链的cDNA为模版进行RT‑PCR扩增，扩增所用引物如下：上游引物NcoⅠ：5’‑ CATGCCATGGGCTCCTACATCCCAGTAGAAATG‑3’下游引物XhoⅠ：5’‑CCGCTCGAGATGACCTCGAATCGACATCT‑3’c．电泳回收RT‑PCR产物与克隆载体pMD19T连接并转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，通过蓝白斑筛选阳性克隆，选择501大小的条带进行回收；d．用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ分别双酶切c步骤所回收产物的质粒和表达载体pET‑32a(+)，将得到的两种目的基因片断用DNA连接酶连接，转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α进行培养并筛选提取重组表达质粒；e．将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）内，培养菌株得到菌种；f. 将所收集的菌种进行扩大培养，经IPTG诱导后收集菌体；g. 将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液。