[发明专利]一种褐飞虱细胞的原代培养方法

摘要

本发明公开了一种褐飞虱细胞的原代培养方法，该方法首先获取发育时间在3天到4天的褐飞虱胚胎，然后配制褐飞虱细胞培养基，采用机械法结合消化法分离褐飞虱胚胎的组织和细胞，最后进行褐飞虱胚胎细胞的原代培养；本发明是对半翅目昆虫细胞培养的重要补充；褐飞虱为水稻重要害虫，本发明有助于在离体条件下研究褐飞虱，为其防治途径的研究和开发提供帮助。

主权项

一种褐飞虱细胞的原代培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）获取发育时间在3天到4天的褐飞虱胚胎：褐飞虱雌成虫和雄成虫配对后放入装有水稻叶鞘的试管中，使它们在28℃条件下产卵；在第二天的同一时间从叶鞘中剥出褐飞虱所产的卵，定义为1天卵；依次获得褐飞虱的3天卵和4天卵；在解剖镜下，3天卵可看到明显的黄斑，而4天卵可观察到眼点；此3天卵或4天卵的发育时期处于反转期前后，适合于后续的胚胎细胞培养；（2）褐飞虱细胞培养基的配制：分别称取12.25g的Schneider’s insect medium、5.35g的Medium 199、25mL 的Medium CMRL 1066（1×）、2.36g的L‑His·HCl·H2O、2.135g的L‑His、149mL‑248mL胎牛血清、0.30g的CaCl2、0.20g的NaHCO3、62mg的氨苄青霉素钠、62mg的硫酸链霉素等成分；上述各成分混合，加入超纯水至1000 mL使上述成分充分溶解，再用2M NaOH或HC1溶液调节pH至6.5‑6.6，而后用超纯水定容至1240 mL，经0.22μm微孔滤膜过滤后置于4℃备用；过滤过程采用无菌操作；（3）机械法结合消化法分离褐飞虱胚胎的组织和细胞：取约100粒褐飞虱3天卵或4天卵，用体积百分比约为75%的酒精表面消毒5‑10分钟，接着用无菌的1× PBS漂洗3遍，而后把卵转移到小细胞培养皿中，加入100 μL的无菌1× PBS，用无菌的弯尖眼科剪把卵剪碎，使卵中胚胎组织裸露到PBS中；用无菌的1mL枪头把含有胚胎组织的PBS吸到1.5 mL的无菌离心管中，800‑1000转/分钟离心5‑10分钟，去除上部PBS，获得胚胎组织沉淀；用100μL质量体积比0.0025g/mL的胰蛋白酶溶液悬浮胚胎组织，37℃条件下消化1‑5分钟；往胰蛋白酶溶液加入一倍体积以上的步骤2配置的褐飞虱细胞培养基终止胰蛋白酶消化，800‑1000转/分钟离心5‑10分钟，去除上清液，获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀；整个过程采用无菌操作；（4）褐飞虱胚胎细胞的原代培养：用褐飞虱细胞培养基1200 μL悬浮上述褐飞虱胚胎组织和细胞沉淀，将其转移到小细胞培养皿或6孔细胞培养板中，用Parafilm封口膜包好后放置于27℃恒温培养箱中培养；第2天，待组织和细胞贴壁后，更换新鲜褐飞虱细胞培养基，并视贴壁细胞生长情况，每隔5‑8天更换一次褐飞虱细胞培养基；1个月后，即可以得到贴壁生长的褐飞虱细胞群；整个过程采用无菌操作。