[发明专利]一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF‑1编码基因的克隆方法

摘要

一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF‑1编码基因的克隆方法，属于生物医药技术领域。以从蟾蜍的皮肤第一链cDNA为模板实施PCR，将获得的PCR产物与转化至E.coli感受态细胞，通过筛选阳性的菌落，质粒回收及酶切，获得能用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF‑1编码基因，其工艺简便，原料充足，获得的编码基因性能稳定。

主权项

一种用于抑制内皮细胞分化的蟾皮钙调素结合蛋白EDF‑1编码基因的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：1）将蟾蜍清洗处死，取其背部皮肤剪成小块后投入液氮中速冻9‑15h，置于‑70℃超低温冰箱保存备用； 2）称取步骤1）中一小块蟾蜍背部皮肤，按RNA提取试剂盒说明提取其总RNA，用Quantscript RT kit合成其皮肤第一链cDNA，备用；3）根据其他两栖类EDF‑1 cDNA序列设计上、下游引物，取步骤2）中第一链cDNA 0.8‑1.5μL，加灭菌超纯水至18‑22μL，加入与第一链cDNA等量的上、下游引物，在50‑98℃循环实施PCR 60‑80min；反应结束后，取一部分PCR产物与pUCm‑T 连接，转化至E.coli 感受态细胞DH5，然后取2‑5mL转化液均匀涂布于LB琼脂盘上，并在37℃恒温培养14‑18h，挑取白色菌落接种于10‑15mL LB培养基中，实施菌落PCR，将通过菌落PCR确定为阳性的菌落0.2‑0.5mL接种于2‑4mL含100mg/mL氨苄青霉素‑的LB培养液中，再次37℃恒温振荡培养14‑18h，然后使用试剂盒进行质粒回收并对其进行EcoR I和Xho I 双酶切，即可。