[发明专利]基于纳米金标记和酪胺信号放大技术测定脱落酸的方法

摘要

基于纳米金标记和酪胺信号放大技术测定脱落酸的方法。以生物素化脱落酸抗体修饰纳米金为标记物，以磁珠为载体，结合酪胺信号放大技术和PIP-HRP-H2O2化学发光体系高灵敏度测定脱落酸的方法。属于化学发光领域。其原理是用抗体修饰磁珠捕获目标物脱落酸；用生物素化脱落酸抗体修饰纳米金，并以其为标记物；然后利用酪胺信号放大技术在磁珠表面聚集链霉亲和素-HRP；再利用PIP-HRP-H2O2化学发光体系实现对目标物的测定。由于通过酪胺信号放大在磁珠表面有大量的链霉亲和素-HRP形成，再利用高灵敏度化学发光检测体系，实现了脱落酸的高灵敏度测定。方法具有简单、成本低、灵敏度高的优势。

主权项

基于纳米金标记和酪胺信号放大技术测定脱落酸的方法，其特征在于以纳米金为标记物和磁珠为载体，以酪胺信号放大技术和PIP‑HRP‑H2O2化学发光体系实现植物激素脱落酸的测定，测定步骤如下：（1）纳米金的制备：将用于制备纳米金的玻璃仪器及聚四氟乙烯搅拌棒用新制王水清洗，再用二次蒸馏水冲洗后烘干备用；再向500mL三口烧瓶中加入250mL水，再加入2.5mL1%HAuCl4，在电炉上加热至沸腾后，快速加入4.4mL1%柠檬酸钠；溶液颜色由淡黄色逐渐变为酒红色，然后继续保持沸10～15分钟，移走热源，在室温下继续搅拌至冷却，定容至200mL，置4℃冰箱冷藏备用；（2）生物素化脱落酸抗体的制备：首先用1mol/LpH9.2的NaHCO3溶液将脱落酸抗体稀释为1mg/mL；用DMF将Bio‑NHS配制成50mg/mL的溶液；然后按Bio‑HNS与脱落酸抗体质量比1:7的比例将其混合，室温下搅拌混匀反应4h，即得生物素化脱落酸抗体；（3）抗体修饰纳米金的制备：在2mL的小试管中加入150μL，10‑7M的巯基丙酸，再加入1mL、0.1M的EDC，活化30分钟；另取一个5mL的小试管，加入2mL纳米金，1mL咪唑缓冲液（0.1M，pH6.8），活化30分钟；将上述两溶液混合反应12小时，磁性分离，弃上清液，再用磷酸缓冲溶液洗三次，定容至2mL；然后将10μg生物素化IgG、3μg生物素化脱落酸抗体加入上述溶液中，混合反应12小时，得抗体修饰纳米金；（4）抗体修饰磁珠的制备：取30μL磁珠于1.5mL小试管中，用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次，加入200μL咪唑‑HCl缓冲溶液（0.1M）和100μL0.2M的EDC溶液，在37℃下反应40分钟；然后用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次，最后加入200μL磷酸缓冲溶液摇匀；再加入10μg抗体，37℃孵育过夜；最后，用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次，磁性分离后，分散于200μL磷酸缓冲 溶液中；再加入200μL0.1g/mL的BSA，并置于37℃下反应40分钟，再用200μL磷酸缓冲溶液洗涤三次，磁性分离后，分散于200μL磷酸缓冲溶液中，得抗体修饰磁珠，4℃冰箱保存备用；（5）生物素化酪胺的制备：分别取10.0mgBio‑NHS和酪胺‑HCl，用DMF溶解，分别配制成10mg/mL的溶液；在配置的酪胺‑HCl溶液中加入三乙胺10μL，室温放置4小时后取17.3μL，与60.2μL的Bio‑NHS溶液混合，室温反应4小时，即得生物素化酪胺，4℃冰箱保存备；（6）脱落酸的测定：取不同量的脱落酸标准溶液或样品溶液加入抗体修饰磁珠溶液中，37℃下反应30分钟；然后加入抗体修饰纳米金，37℃下反应30分钟，磁性分离，并用磷酸缓冲溶液洗涤三次后分散于磷酸缓冲溶液中；然后加入生物素化酪胺溶液，再加入体积分数为0.5%的过氧化氢溶液，在37℃避光孵育30分钟，用含0.05%（体积分数）吐温‑20的磷酸缓冲液洗涤三次；然后再加入链霉亲和素‑HRP，37℃孵育30分钟，用磷酸缓冲溶液洗涤三次后分散于磷酸缓冲溶液中；然后进行化学发光测定，根据标准溶液浓度和化学发光信号关系作图得标准曲线；根据所测定样品溶液的化学发光信号对样品中脱落酸含量进行定量；（7）样品分析：将微纳米级微透析探针插入模式植物内部，对植物激素进行微透析无损伤原位、实时取样，在通道下游待测组分按步骤（6）方法进行实验，根据化学发光信号和步骤（6）所得标准曲线可以获取植物激素脱落酸的含量。