[发明专利]以玉米胚珠为受体的转基因方法

摘要

本发明涉及一种以玉米胚珠为受体的转基因方法，属于植物基因工程技术领域，应用农杆菌侵染介导的遗传转化原理，以授粉后的玉米胚珠为受体，在靠近珠孔的位置刺穿胚珠壁后，将含有目标基因的农杆菌侵染液滴入胚珠，经过共培养、幼胚诱导、分化再生、生根、分子鉴定等步骤，最终获得转基因玉米植株。其不但可以有效解决传统玉米转基因方法存在的基因型有限、组织培养操作繁琐、转化周期长等技术难题，而且具有转基因植株可育性提高、目标基因高效表达及稳定遗传等优点，对玉米基因工程的理论研究和遗传育种实践均具有重大意义。

主权项

以玉米胚珠为受体的转基因方法，其特征在于具体步骤如下：1）农杆菌侵染液的制备：挑取含目标基因的农杆菌单菌落接种于YEP液体培养基中，在28℃，180rpm振荡培养过夜，4000rpm，4℃离心10min后收集菌体，重悬于pH 5.2的侵染培养基中，调节菌液浓度至OD600 = 0.3‑0.4后存于4℃备用；2）玉米胚珠受体的分离：玉米雌穗抽丝前套袋，在花丝已抽出5‑10cm时自花授粉，于花丝授粉后24h取下雌穗，首先用70%酒精擦拭苞叶，并小心剥开内部苞叶，然后把雌穗在1.5%次氯酸钠中浸泡15min，无菌水至少洗3次；在超净工作台上用解剖刀将雌穗在麦芽糖溶液（90 gl）中取下中部胚珠，用直径为0.4mm的注射针在胚珠壁靠近珠孔的位置刺穿胚珠壁；3）农杆菌侵染转化与培养：将10µl农杆菌侵染液置于胚珠表面，侵染5min后，吸除表面多余菌液；将农杆菌侵染转化后的胚珠转入pH 5.8的共培养培养基，每个培养皿约接种25个胚珠，23℃暗培养3天；共培养阶段结束后，将胚珠转移到pH 5.8的诱导培养基中，25℃光照培养1‑2周，光/暗周期为16/8h，直至小苗出现主茎；将小苗转移到pH 5.8的生根培养基，经25℃光照培养2‑4周，光/暗周期为16/8h，当小苗长至10cm时，移栽至带土的花盆中；4）转基因植株的分子鉴定：采用PCR或Southern杂交检测转基因植株，将阳性植株在温室中培养至成熟。