[发明专利]一种从水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法

摘要

本发明提供了一种从转基因水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的层析方法，包括以下步骤（1）以重组人乳铁蛋白转基因水稻种子为原料，采用提取缓冲液制备rLF粗提液；（2）用阳离子交换层析分离纯化rLF粗提液，获得纯化的rLF目标物。所述层析方法还进一步包括填料再生的步骤。

主权项

一种从转基因水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的层析方法，依次包括以下步骤：1)从转基因水稻种子中提取重组人乳铁蛋白，获得含重组人乳铁蛋白的粗提液；其中，所述提取包括下述步骤：(a)以重组人乳铁蛋白转基因水稻种子为原料，将稻谷脱壳成半精米并研磨成80‑100目的米粉；(b)将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:5‑1:10的比例混合，常温下提取0.5‑2小时，获得混合物；所述提取缓冲液为：10‑25mMTris、10‑25mMNaAC，0‑250mMNaCl，pH6.0‑7.5；(c)将混合物过滤，得到含重组人乳铁蛋白的粗提液；2)将由步骤(1)获得的含重组人乳铁蛋白的粗提液经过阳离子交换层析，进行初级分离纯化，获得含重组人乳铁蛋白的洗脱液；其中：所述阳离子交换层析介质为CMsepharose FF弱阳离子交换填料，层析步骤为：2A)采用5‑15倍柱体积的pH为6.0‑7.5的10‑25mMTris、10‑25mMNaAC，0‑250mMNaCl缓冲液，以50‑200cm/小时的流速平衡层析柱；2B)以步骤1)的粗提取液作为上样样品，其中样品电导为2‑25ms/cm，pH为6.0‑7.5；用洗杂缓冲液洗脱杂质，洗杂缓冲液含3‑10mMNaH2PO4，3‑10mMNa2HPO4，200‑300mMNaCl，pH6.5‑8.0，洗脱流速为50‑200cm/小时；2C)用3‑10mMNaH2PO4，3‑10mMNa2HPO4，400‑650mMNaCl，pH6.5‑8.0洗脱缓冲液以50‑200cm/小时的流速洗脱样品，得洗脱液；3)收集步骤2)所述洗脱液，获得含重组人乳铁蛋白的溶液；由所述方法获得的重组人乳铁蛋白的HPLC纯度高于95％；4)在步骤3)之后将使用后的层析柱填料通过下述步骤再生：4a)以3‑10倍柱体积1‑2MNaCl，pH6.5‑10.0的高盐溶液以50‑200cm/小时的流速冲洗柱子至UV280无明显变化；4b)以3‑10倍柱体积5‑25mM柠檬酸钠，pH2.0‑4.0的缓冲溶液以50‑200cm/小时的流速冲洗柱子；4c)以2‑5倍柱体积的0.5‑1.0MNaOH溶液以30‑100cm/小时的流速反冲层 析柱；4d)以8‑15倍柱体积的超纯水冲洗柱子至pH小于10.0，将填料保存在20％的乙醇溶液中。