[发明专利]一种马精子冷冻保存液及其冷冻方法

摘要

本发明提供的一种马精子冷冻保存液及其冷冻方法，首次经特殊处理后马奶和卵黄低密度脂蛋白同时应用于精子冷冻保存液中；冷冻过程中采用分步添加冷冻保存液、控制性降温、更低的液氮熏蒸高度及更短的熏蒸时间，该技术显著改善了马精子冷冻的质量，极大的提高了马冷冻精液人工授精的效率。

主权项

一种马精子冷冻保存液及其冷冻方法，其特征在于：分步骤实施;一、冷冻保存液和离心液的配制1）马奶的处理方法用双蒸水与食用菜籽油1:1混合，70℃水浴3min，剧烈摇动5min，常温静止至水油分离，去除水，再油水混合，水浴摇动、静止去水，如此再重复2次，4500转离心5min，收集油；将收集油与新鲜马奶1：6混合，摇匀后置于70℃水浴5min，剧烈摇动5min，4500转离心20min，回收中层奶至玻璃瓶中，密封后放入高压灭菌锅中90℃灭菌30min，备用；2）低密度脂蛋白的制备取新鲜鸡蛋的蛋黄15ml，用9.945g/L氯化钠溶液40ml稀释，在4℃搅拌1h后，以10000×g离心力，离心42‑47min，离心后收集的上清液与40％的硫酸铵溶液2：1混合，调整pH至8.7，在4℃下搅拌lh后，再以10000×g离心力，离心43‑46min ，弃去沉淀物，将上清液置于透析袋中蒸馏水透析10‑13h，以10000×g离心力，再离心44‑48min，得上清即为低密度脂蛋白;将低密度脂蛋白均匀的铺在表面皿上，放入冻干机中处理，待其完全变成粉末，置于冰箱中保存；3）糖盐溶液的配制原料由葡萄糖4.5‑6g、乳糖250‑350mg、棉子糖250‑350 mg、2水合柠檬酸钠58‑62 mg、柠檬酸钾80‑84 mg、羟乙基哌嗪乙磺酸950‑958mg、去离子水95‑110 ml组成;将葡萄糖、乳糖、棉子糖、2水合柠檬酸钠、柠檬酸钾、羟乙基哌嗪乙磺酸、去离子水依次置于容器中，混合均匀后，在70℃下消毒30min，备用；4）离心液配制原料由糖盐溶液45‑55ml、处理马奶45‑55ml、低密度脂蛋白8‑11 g、青霉素5000UI、庆大霉素4‑6g、两性霉素 B 23‑27 mg组成;无菌操作,先将糖盐溶液与处理马奶混合，再依次加入低密度脂蛋白、青霉素、庆大霉素、两性霉素 B，摇动2min，用10%碳酸氢钠调整溶液pH值至6.5‑7.0，最后用25%的葡萄糖溶液或双蒸水调整溶液渗透压至300‑350 mOsm/L;5）冷冻保存液配制原料由离心液93‑94ml、甘油6.0‑7.0 ml组成;无菌操作,将离心液与甘油混合摇动2min，即得冷冻保存液;二、精液冷冻方法①采精前20‑25min，将载有离心液离心管置于35℃水浴中预热，将载有冷冻保存液的离心管置于22℃水浴中预热；②采集精液，活力即直线运动精子比例达到40%以上，可进行冷冻；③取②精液与①离心液按1:1比例混合，在22℃下水浴10min，使混合液温度降至22℃;④取③稀释混合物置于离心管，在580‑ 620 ×g离心力条件下，离心10min，弃上清，留下浓缩液;⑤取④浓缩液加入1.5倍体积的冷冻液，将装有该混合液的离心管置于盛有22℃100ml温水的烧杯中，再将该烧杯置于5℃冰箱中， 58‑63min后，向装有精子混合液的离心管中再次添加5℃等体积的冷冻液保存液,添加完成后缓缓摇匀，在5℃下再放置1h;⑥在5℃温度下，将经⑤处理的精子混合液装入0.5ml细管中封口，置于液氮面上1.5‑3cm上熏蒸5‑8min后，直接放入液氮中冷冻；⑦将细管冻精从液氮中取出,置于38℃水浴中，30秒，即精子解冻。