[发明专利]一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法

摘要

本发明涉及一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，包括：以酿酒酵母BY4742α单倍体为出发菌株，针对三酰甘油代谢中起主要作用的水解酶编码基因TGL3、TGL4进行敲除，同时高表达PAH1基因，人为制造TAG代谢障碍，造成胞内TAG过度积累，建立酵母肥胖模型，并利用该模型进行降脂药物的初步筛选及药效评价。本发明构建出的肥胖酵母模型主要有实验周期短，建设成本低，运行耗费少，操作简便等优势；能够为酵母和人类脂类代谢机制研究及降脂药效评价提供平台，是一个高效而可靠，简便快捷的降脂药物筛选模型。

主权项

一种TAG代谢障碍型肥胖酵母模型的构建方法，包括：（1）以酿酒酵母BY4742α作为敲除对象，设计含有酿酒酵母基因组上TGL3和TGL4基因上下游同源序列的引物，利用PCR技术，以PRS400系列质粒为模板，扩增出含有筛选标记的DNA片段；通过酿酒酵母电转化技术，将该DNA片段转入酿酒酵母中，利用筛选型培养基筛选TGL3TGL4双缺陷型酵母；（2）利用PCR技术扩增获取PAH1上下游序列，并通过在扩增引物上分别设计上游的promoter区中的HindIII、NOTI和下游的terminator区中的BamHI、NOTI四个酶切序列及相应的保护碱基，以三片段一次性连接的方式将PAH1上下游序列插入到表达质粒YEplac195中；通过NOTI及terminate区上的PstI酶切位点对构建好的YEplac195‑promoter‑terminator进行双酶切，创造出一个酵母难以通过自身连接修复的缺口Gap，通过酿酒酵母电转化技术，将含有该Gap的质粒转入酵母，使酵母以自身基因组作为修复Gap的模板，将PAH1基因复制到质粒中；通过筛选平板剔去没有成功复制PAH1或修复YEplac195的酵母，针对筛选出来的酵母以酵母质粒提取技术进行质粒提取，并借助大肠杆菌DH5α进行富集，得到PAH1高表达质粒YEplac195‑PAH1；（3）利用酿酒酵母高效转化方法将PAH1高表达质粒YEplac195‑PAH1转入TGL3和TGL4缺陷型酵母中，得到TAG代谢障碍型肥胖酵母模型。