[发明专利]一种定量检测蛋白乙酰化水平的方法

摘要

本发明属生物技术领域，具体为一种定量检测蛋白乙酰化水平的方法。具体包括蛋白芯片制备，绘制标准曲线和实际样品检测。该法克服了用乙酰化抗体直接免疫沉淀富集时抗体亲和力弱而难以高效富集乙酰化蛋白的弊端，能快速，简便地定量检测蛋白乙酰化水平，使用的样品量较少，有利于不同样品之间的差异比较，同时研究乙酰化差异谱图为建立高通量蛋白质乙酰化修饰差异谱分析提供技术平台，有利于探讨乙酰化状态对肝癌转移的预测价值。

主权项

一种定量检测蛋白乙酰化水平的方法，其特征在于：具体步骤如下：（1）制备蛋白芯片利用芯片点样仪器，在三维凝胶芯片上点1‑3nL蛋白抗体PBS溶液，点好后储存于4℃冰箱待用，其中所述蛋白抗体PBS溶液的质量‑体积浓度为100‑300µg/ml；（2）绘制标准曲线将步骤（1）制备好的蛋白芯片，用山羊血清PBS‑T溶液封闭1‑2小时, 洗涤，甩干；之后用磷酸缓冲液稀释得到的10倍稀释的肝癌病人血清作为稀释液稀释乙酰化蛋白抗原得到的不同浓度的标准乙酰化蛋白抗原溶液孵育1‑2小时，洗涤，甩干；接着用生物素标记的检测抗体PBS溶液孵育1‑2小时，洗涤，甩干；再用荧光标记的链霉素PBS溶液孵育0.5‑1小时，洗涤，甩干；最后利用激光共聚焦芯片扫描仪扫描上述处理完毕的芯片，检测点样点的荧光强度，绘制标准曲线，得出标准乙酰化蛋白抗原溶液的浓度和信号之间的线性关系；其中，所述山羊血清PBS‑T溶液的体积百分比浓度为1%‑10%，所述标准乙酰化蛋白抗原溶液的质量‑体积浓度分别为0.25µg/ml、0.5µg/ml、0.75µg/ml、1µg/ml、2µg/ml、4µg/ml、6µg/ml、8µg/ml，所述生物素标记的检测抗体为生物素标记的乙酰化抗体，所述生物素标记的检测抗体PBS溶液质量‑体积浓度为0.5‑2.5µm/ml，所述荧光标记的链霉素PBS溶液质量‑体积浓度范围为5‑20µm/ml； （3）实际样品检测将步骤（1）中制备的蛋白芯片用山羊血清封闭后，用待测样品孵育，洗涤，甩干；接着用生物素标记的检测抗体孵育，洗涤，甩干；再用荧光标记的链霉素孵育，洗涤甩干，其中所述生物素标记的检测抗体为生物素标记的乙酰化抗体，反应具体条件同步骤（2）；芯片处理完毕后，利用激光共聚焦芯片扫描仪扫描，检测点样点的荧光强度，再根据标准曲线定量待测样品的蛋白乙酰化水平。