[发明专利]一种提取枯草芽孢杆菌基因工程菌质粒的方法

摘要

本发明公开一种提取枯草芽孢杆菌基因工程菌质粒的方法，包括以下步骤：1）枯草芽孢杆菌菌体的培养与收集；2）原生体的制备；3）细胞的裂解和提取；4）质粒的纯化。应用该方法得到的质粒DNA可直接用来限制性内切酶消化、PCR扩增等多种分子生物学实验。本发明操作简便、安全、质量高，可同时适用于多种革兰氏阳性细菌质粒DNA的提取，因此具有广泛的适用性。

主权项

一种提取枯草芽孢杆菌基因工程菌质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）菌体的培养与收集：挑取枯草芽孢杆菌的单菌落于2‑10ml LB液体培养基中28‑35℃振荡培养10‑15小时，0.5‑5wt%转接到40‑150ml新鲜LB液体培养基中继续振荡培养，至细菌生长密度为OD600＝0.5‑1.2，收集40‑150mg菌体于离心管中；2）原生体的制备：向收集的菌体中加入1‑1.5ml预冷的洗涤液A悬浮细胞，离心弃上清，菌体重悬于200‑300μl细胞裂解液B，37℃温育1.5‑2h；3）细胞的裂解和质粒的提取：向制备好的上述溶液中加入200‑300μl溶液C，缓慢混匀，68℃处理10min，裂解细胞，向裂解液中加入100‑150μl溶液D，轻轻混匀，于‑20℃中放20‑30min；4℃离心，将上清液转移至新离心管内，加入无水乙醇，‑20℃过夜；4℃离心，弃上清，70wt%乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀，加入无菌纯水溶解沉淀；4）质粒的纯化：将制备好的上述溶液转移到一个干净的离心管中，加入2‑5倍体积DNA联接液E到离心管中，用手颠倒1‑5分钟混匀；将联接混合液加入一个含结合柱的收集管中，室温放置1‑5分钟，3000‑10000rpm离心1‑3分钟，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入离心管中，再次加入联接混合液离心，直至所有联接混合液离心完毕；将含结合柱的收集管放置在一个新的离心管中，加入300‑700μl洗涤液F到结合柱中，离心，倒掉收集管中的废液；将结合柱重新放回收集管，8000‑18000rpm离心1‑5分钟；将结合柱装入新的离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30‑50μl洗脱液G，不戳破膜，室温放置，8000‑15000rpm离心1‑3分钟，离心管中即为分离的DNA，贮存于‑20℃；其中洗脱液G为0.1mM的Tris‑HCl，pH=9.0。