[发明专利]一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法

摘要

本发明涉及细胞色素P450酶，特别涉及一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法。一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于在步骤D所述的辅助因子为如下任意一种：①0.5-6μg/mlHemin；②0.05-0.6mM5-ALA；③0.01-0.4mMFe3+；④0.05-0.6mM-ALA和0.01-0.4mMFe3+混合物，首次对CYP蛋白、POR蛋白及其共表达的条件进行了系统优化，结果发现同时给予0.02mMFe3+和0.2mM5-ALA处理细胞，上述蛋白表达水平及其活性最高。CYP的MOI为5pfu/细胞、POR的MOI为2pfu/细胞时，两者的共表达效率最高。

主权项

一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于具体制备方法如下：A、重组转移载体pFastBac1‑ POR质粒的构建与鉴定双酶消化重组质粒pcDNA3.1(+)/POR和转移质粒载体pFastBacTM 1 ，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的片段；用T4 DNA连接酶连接回收的POR基因与载体pFastBac 1片段，构建重组转移载体质粒pFastBac1‑POR；经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得含重组质粒的大肠杆菌，提取菌液DNA，获得重组转移载体质粒DNA；使用双酶切消化验证pFastBac1‑POR；B、重组真核表达病毒Ac‑Bacmid‑ POR DNA的构建与鉴定将已构建好的pFastBac1‑ POR重组质粒转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，在DH10Bac大肠杆菌的助手质粒Helper辅助下经Tn7转座子转座，将各POR的基因片段插入穿梭载体Bacmid中，经卡那霉素、庆大霉素和四环素三抗筛选和蓝白斑筛选，得到重组Ac‑Bacmid‑ POR DNA，用PCR反应进行验证；C、重组真核表达病毒Ac‑Bacmid‑ POR的获得在6孔板接种9×105个细胞/孔，27℃贴壁1h；现配杆粒DNA与Cellfectin转染试剂复合物对细胞进行转染，27℃孵育5h后，加入2ml Sf‑900 II SFM培养液，其中所述的Sf‑900 II SFM培养液含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml；27℃孵育72h或直到看到病毒感染的迹象为止；收取含有目的基因的第一代重组病毒液，再用此病毒液感染Sf9细胞，收取第二代重组病毒液，可以保存备用或感染Sf9细胞以得到更高效价的病毒液；D、重组POR蛋白的表达使用重组病毒液感染Sf9细胞，加入辅助因子，以表达有活性的POR蛋白；感染后72小时收集细胞，超声破碎细胞，然后差速离心分离出细胞中的微粒体蛋白，分装后‑80℃保存备用；其中步骤D所述的辅助因子为0.2 mM 5‑ALA与0.02mM Fe3+混合物。