[发明专利]一种构建转基因家蚕微孢子虫的方法

摘要

本发明公开了一种构建转基因家蚕微孢子虫的方法，在家蚕微孢子感染的家蚕体腔注射脂质体包裹的转基因载体，2～4天后取蚕血淋巴加入家蚕BmN培养细胞中培养；当微孢子虫呈绿色荧光时，用昆虫培养基极度稀释，加入到细胞培养板中，选择仅有一个培养细胞呈现绿色荧光的培养孔，添加正常培养细胞培养2～4天，获得感染培养细胞；重复至少3次，取获得的感染培养细胞，匀浆破碎细胞，差速离心，纯化微孢子，感染家蚕，家蚕发病后，从感染组织纯化获得转基因家蚕微孢子。运用本发明的技术方案可以将外源基因整合进家蚕微孢子虫基因组，实现了用基因工程技术改造家蚕微孢子虫，实现调节微孢子虫基因的表达水平，为微孢子虫基因功能研究提供了方法。

主权项

一种构建转基因家蚕微孢子虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 用家蚕微孢子感染家蚕，感染后3～4天，体腔注射脂质体包裹的转基因载体，继续饲养；(2) 2～4天后取家蚕的蚕血淋巴，用荧光显微镜进行观察，若观察到有部分血细胞呈绿色荧光，则取该家蚕的蚕血淋巴加入家蚕BmN培养细胞中，25～27℃培养；若没有观察到绿色荧光，则重复步骤(1)和(2)；(3) 每隔2～3天，吸出一半旧培养液，补加新鲜培养基和正常家蚕BmN培养细胞，25～27℃培养；(4) 每天采用荧光显微镜观察培养细胞，当发现感染培养BmN细胞内的微孢子虫呈现绿色荧光时，取出部分感染培养细胞，提取总DNA,用荧光蛋白基因的特异性引物进行PCR扩增，当扩增出荧光蛋白基因的特异性条带时，取未使用的部分感染培养细胞，进行步骤(5)，否则重复步骤(4)；(5) 取部分感染培养细胞，用昆虫培养基极度稀释，加入到细胞培养板中，荧光显微镜观察，选择仅有一个培养细胞呈现绿色荧光的培养孔，添加新鲜正常培养细胞，25～27℃培养2～4天，获得感染培养细胞；(6) 重复步骤(5)至少2次，每次采用上一次获得的感染培养细胞作为本次的初始感染培养细胞；(7) 取经过上述处理的感染培养细胞，匀浆破碎细胞，差速离心，纯化微孢子；取部分微孢子虫提取微孢子虫DNA，用荧光蛋白基因的特异性引物进行PCR扩增，如果扩增出荧光蛋白基因的特异性条带，则用获得的微孢子虫感染家蚕，家蚕发病后，从感染组织纯化获得转基因家蚕微孢子。