[发明专利]冻存和复苏脐带全细胞并分离和扩增干细胞的方法

摘要

本发明涉及脐带全细胞分离、冻存和复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法，其包括如下步骤：对脐带组织进行消毒和清洗；将组织剪成块状，消化处理1.5小时；配制脐带组织冻存液备用；将消化处理得到的全细胞和冻存液加入冻存管中，在4℃的温度条件下低温冷藏0.5小时，再-80℃的温度条件下冷冻1天，然后液氮中冷冻备用；需要时将脐带全细胞从液氮中取出，恒温水浴解冻，利用间充质干细胞培养基进行点滴法清洗，复苏的脐带全细胞可通过细胞培养和细胞传代扩增间充质干细胞。本发明方法可有效保护冻存脐带组织，且方便复苏使用，尤其适合复苏后分离和扩增间充质干细胞。

主权项

处理脐带全细胞的方法，该方法包括：(A)以下对脐带离体新鲜组织全细胞进行分离和冻存的步骤：(1)消毒和清洗：用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞；(2)消化处理：将步骤(1)得到的脐带组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液(例如其非限制性地包含I型胶原酶、DMEM‑F12)中，消化处理0.5‑3小时(例如1.5小时)，过滤清除组织块，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗；(3)配制脐带全细胞冻存液：所述脐带全细胞冻存液中包含人血白蛋白和DMSO(二甲基亚砜)，配好的冷存液放在1℃至7℃(例如4℃)的温度条件下低温冷藏；(4)脐带全细胞冷存：在0‑15℃(例如1℃至7℃，例如4℃)的低温环境下，将步骤(3)得到的全细胞冻存液加入步骤(2)得到的清洗后的细胞中以重悬细胞，然后将重悬细胞加入冻存容器中，冻存容器放入程序降温装置，先在1℃至7℃(例如4℃)的温度条件下低温冷藏0.2‑2小时(例如0.5小时)，再在‑10℃至‑150℃(例如‑80℃)的温度条件下冷冻0.25‑3天(例如1天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用；(B)以下对冻存的脐带离体新鲜组织全细胞进行复苏的步骤：(5)冻存脐带全细胞复苏：将步骤(4)冷冻的脐带全细胞从液氮中取出，解冻至20%‑70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗细胞，以使冻存的脐带全细胞复苏；(C)以下对复苏的脐带全细胞进行间充质干细胞分离和扩增的步骤：(6)细胞培养：向步骤(5)得到的细胞中补加适量(例如1‑6倍细胞悬液体积量)的间充质干细胞培养基，放入培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2‑7天(例如第3‑6天，例如第4天，例如第5 天)时将培养容器从培养箱中取出，补加适量(例如0.2‑2倍细胞液体积量)间充质干细胞培养基，继续培养，在第8‑11天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养，往后每1‑3天(例如2天)进行一次全换液；(7)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%‑70%(例如60%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1‑3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70‑90%(例如80%)后，即得脐带间充质干细胞，必要时进行传代；以及任选的(D)下列一个或多个步骤：(8)对针对步骤(7)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA‑ABC/DR配型；(9)将步骤(7)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冷冻，备用。