[发明专利]一种离体灌流心脏活性氧族和线粒体膜电位的检测方法

摘要

一种离体灌流心脏活性氧族和线粒体膜电位的检测方法，通过离体灌流心脏缺血再灌注模型的建立，实现将离体心脏灌流系统与探针负载装置及激光共聚焦显微镜的关联，进而进行活性氧族和线粒体膜电位的荧光探针的实时负载和显微镜成像，最后通过图像处理和数据分析，本发明能够对稳定灌流状态下以及以急性超负荷、缺血再灌注等为代表的多种离体心脏模型中心脏ROS和线粒体膜电位进行实时、定位测量。本发明具有直接、准确、可见、时间和空间定位，与搏动心脏代谢与功能同步测量的特点，而且成本低，效率高，可信度与重复性好。

主权项

一种离体灌流心脏活性氧族和线粒体膜电位的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，离体心脏灌流模型的建立，取小型哺乳动物经肝素化、麻醉后迅速开胸取出心脏并固定于Langendorff灌流系统，经主动脉逆行灌流以95％O2+5％CO2混合气体饱和的37℃下pH 7.4的K‑H液：115mmol/L的NaCl，25mmol/L的NaHCO3，11mmol/L的glucose，4.0mmol/L的KCl，1.5mmol/L的CaCl2，0.9mmol/L的MgSO4，0.9mmol/L的KH2PO4，为实时测量心脏收缩功能，在左心房肺静脉入口处剪一开口，将一连接于压力传感器的球囊经左心房插入左心室，完全排出球囊内空气后充入去离子水直至达到5‑10mmHg的初始舒张压，由多道生理记录系统连续实时采集左室压力指标，心率HR、左室收缩压LVSP、左室舒张末压LVEDP、左室压变化最大速率±LV dP/dtmax的数据，由计算机自动记录并计算处理进行心功能评价，第二步，离体灌流系统与探针负载装置和显微镜的仪器关联，采用Zeiss LSM 510共聚焦显微镜，载物台正中放置3‑5cm直径、1‑1.5cm高的光学玻璃皿，将灌流心脏左室心尖部贴于玻璃皿上，将灌流管道末端钳夹固定，保证心脏稳定贴于玻璃皿上避免移位，玻璃皿侧壁放置一引流管，经蠕动泵驱动可自动引流灌流心脏的流出液，荧光探针的负载利用微量泵装置，将置于注射器内的探针浓缩液经微量泵匀速泵入，注射器通过软管接三通与心脏灌流装置的灌流终端相连，通过三通的开闭和微量泵泵速调节以控制荧光探针浓缩液的输入时机和输入速度，第三步，荧光探针负载，离体心脏于基础灌流状态下稳定15‑20分钟后，给予针对O2‑、H2O2、线粒体特异性O2‑、和线粒体膜电位的荧光探针：使用胞浆O2‑荧光探针DHE时用2.5×10‑6mol/L的Vybrant Ruby衬染细胞核，使用胞浆 H2O2荧光探针DCFDA时用1μg/ml的DAPI衬染细胞核，使用线粒体特异性O2‑荧光探针MitoSOX Red时用2.5×10‑6mol/L的Vybrant Ruby和5×10‑7mol/L的MitoGreen衬染细胞核和线粒体，使用线粒体膜电位荧光探针TMRE时使用1μg/ml的DAPI和5×10‑7mol/L的MitoGreen衬染细胞核和线粒体，荧光探针负载浓度与速度通过设置微量泵泵入速度控制，微量泵泵入速度＝探针工作液浓度/探针浓缩液浓度*100％，采用二联或三联负载方法，所用荧光探针特异性、工作浓度及荧光显微镜成像时所用激发/吸收波长见下表，注：表中所用荧光探针均来自Molecular Probes，TMInvitrogen第四步，实施实验干预手段，包括建立离体心脏缺血再灌注、心脏急性过负荷、心脏调频和给药模型，第五步，激光共聚焦显微镜成像，荧光采集平面聚焦于距心外膜30μm处的心肌组织内，图像采集过程中如因心脏搏动速度过快造成伪影，则在灌流液中加用肌纤维抑制剂5‑10mM的Blebbistatin以降低心率，待荧光探针负载10‑15分钟后，对灌流心脏中荧光信号进行连续扫描，设置扫描间隔时间为5分钟， 分别以所用荧光探针所对应的激发/吸收波长在63倍油镜下成像，扫描速度每帧0.7秒，第六步，图像处理和分析，ImageJ软件计算荧光信号强度，其中胞浆O2‑水平用DHE在405nm和514nm不同吸收波长下的荧光强度比值表示，线粒体O2‑水平用MitoSox Red在405nm和514nm不同吸收波长下的荧光强度比值表示，胞浆O2‑用Vybrant Ruby所代表的细胞核信号做权重，胞浆H2O2用DAPI所代表的细胞核信号做权重，线粒体特异性O2‑用Vybrant Ruby和MitoGreen所代表的细胞核和线粒体信号做权重，线粒体膜电位荧光信号用DAPI和MitoGreen所代表的细胞核和线粒体信号做权重。