[发明专利]添加抗氧化剂CAT和VE制备家畜性控冷冻精液的方法

摘要

一种添加抗氧化剂CAT和VE制备家畜性控冷冻精液的方法，属于动物繁殖技术领域，主要利用抗氧化剂CAT(过氧化氢酶)和VE(维生素E)能够抵抗携带有自由基的活性氧族(ROS)特点，在精子分离、冷冻的过程中添加CAT和VE，降低活性氧族对精子造成的过氧化损伤的作用，有效保护家畜精子分离、冷冻过程中精子生理机能，从而提高解冻后精子活力和延长精子存活时间，从而制备能够正常受精受胎的家畜性控冷冻精液的方法。

主权项

1.一种添加抗氧化剂CAT和V_E制备家畜性控冷冻精液的方法，它包括以下步骤：(1)、CAT液和V_E液的配制：室温下称取4.2mg的CAT加入1ml的蒸馏水中溶解，避光保存在-20℃，保存期限为一周；称取4mg的V_E加入1ml的DMSO中溶解，避光保存在4℃，保存期限为一周；(2)、家畜原精的抗生素补加：按照1ml家畜原精添加6μl林可-奇霉素、6μl泰勒霉素、8μl东大霉素的比例在家畜原精中添加抗生素；(3)、精子分离：1)将补加好抗生素的家畜原精用50μm精液过滤器过滤至新的离心管中，除去原精液中的杂质，过滤后使用密度仪检测原精实际浓度，置18-20℃冰箱中保存；2)计算六台分离机用于染色的原精体积数＝六台分离机每小时分离精子总数12亿/原精实际浓度；3)根据步骤2)计算好的用于染色的原精体积数，用15ml离心管从步骤1)中取出原精，补加Staining Talp到3ml，360g离心洗涤，5分钟；4)在另一个新的离心管中按照12亿原精加入75μl Hoechst33342荧光染料、加入6ml Staining Talp的比例，将Hoechst33342荧光染料和Staining Talp进行混合，并用悬浮振荡器轻微振荡3秒，其中，Hoechst33342荧光染料的浓度为5mg/ml；5)步骤3)离心停止后，吸弃2ml上清液，保留体积1ml，将其转移至上述步骤4)的15ml离心管中，34℃染色45分钟后，加入6ml的4％eggyolk；6)把步骤5)染色处理的原精按每个分离管2亿原精进行分装，把分装好染色后的原精样品放入分离机的样品台内，分离原精；7)根据分离机上的读数记录每台分离机的精子分离总数，计算六台分离机的精子分离总数＝每台仪器分离数×6(单位：千万)；8)从-20℃冰箱中取出的buffer缓冲液中，按照1ml添加5μl CAT液、1μl V_E液的比例，添加抗氧化剂CAT液和V_E液，室温预热半小时，作为分离后精子的回收液，所说的buffer缓冲液含84％的TrisA冷冻平衡液和16％超纯水；分离精子下机后，在4℃条件下平衡90分钟，850g离心20分钟后，弃上清液，将精子沉淀，用悬浮振荡器进行轻微震荡，震荡后将所有分离后 的精子都倒入一个空离心管中；(4)、添加抗氧化剂性控冻精的制备：1)在Tris-A、Tris-B中添加抗氧化剂，添加比例为：1ml Tris-A分别添加51μlCAT液、1μl V_E液，1ml Tris-B分别添加5μlCAT液、1μl V_E液，添加完抗氧化剂后，将Tris-A、Tris-B分别混合均匀，放在4℃条件下平衡90分钟；2)根据下机分离的总精子数计算由步骤1)平衡好的Tris-A的用量，M代表Tris-A与精子沉淀的总质量，M(g)＝下机分离的总精子数÷10×80％×1.03÷2，首先将精子下机分离的总数由百万换算成千万，乘以80％的回收率就是精子体积，乘以平均密度1.03g/ml，就是添加Tris-A与Tris-B的总质量，除以2就是添加由步骤1)平衡好的Tris-A的质量；3)将步骤(3)中的步骤8)的装有所有分离后精子的离心管放在电子天平上，往离心管中加入由步骤1)平衡好的Tris-A，直到读数为步骤2)所算出的M(g)为止；4)甘油化：取与M(g)等量的由步骤1)平衡好的Tris-B，分2次间隔15分钟等量加入上述步骤(4)中步骤3)的离心管中，每次添加后颠倒轻轻摇匀；5)装管和冷冻保存：分离精子摇匀后，在4℃条件下装入0.25毫升精液冷冻管；6)把每300支为标准单层摆放到冷冻搓板上，调整液氮罐气层高度为液氮面上12.6in，用吸尘器抽吸液氮气层至-125±1℃后，把产品放置在8.5-9.0cm的气层位置上进行冷冻处理20分钟，然后，把每25支细管装在一个塑精筒内，将标号、日期、批次和支数、冻精人等信息标记在白色标签上，产品转移时，空气中不能超过3秒，最后投入-180℃液氮保存；所说的Staining Talp：PH＝7.4，其组成为：所说的4％eggyolk：PH＝5.5，其组成为：所说的buffer缓冲液的组成为：Tris-A 84％纯水   16％。