[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞的分离纯化及鉴定方法

摘要

本发明公开了一种人羊膜间充质干细胞的分离纯化及鉴定方法，hAMSCs的分离方法为将人羊膜剪成碎片，用EDTA的胰蛋白酶，DNaseI的胶原酶分二步旋转消化，用钢网过滤，收集细胞滤液即为分离的原始hAMSCs；hAMSCs的纯化方法是原始hAMSCs用LG-DMEM培养基置于CO2培养箱培养，在倒置显微镜下除去完全未贴壁生长的羊膜上皮细胞，第3天更换新的培养基，待细胞汇合度达80~90%后，用胰蛋白酶—EDTA溶液消化收集细胞即可获得高纯度的hAMSCs；hAMSCs的鉴定方法采用免疫细胞化学染色波形蛋白和CK19以鉴别hAMSCs和羊膜上皮细胞，采用流式细胞术检测CD29、CD44、CD166、CD34和CD45的表达。本发明方法具有hAMSCs高收率、高活性、高纯度优点，鉴定方法简便、精准。

主权项

一种人羊膜间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：第一，无菌采集人足月剖宫产胎盘，机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D‑Hank’ s液冲洗数次以清除残留血迹，将羊膜剪成碎片；第二，羊膜碎片加入含0.02%EDTA的0.05%胰蛋白酶消化溶液，于37°C，旋转消化弃上清；重新加入消化液，于37°C旋转消化弃上清，留取未消化的羊膜碎片；第三，D‑Hank’s液冲洗未消化的羊膜碎片，加入含有0.075 mg/ml DNase I的0.75 mg/ml的胶原酶，于37°C，旋转消化约2 h至组织完全消化，300目钢网过滤，收集细胞滤液，离心得到原始的人羊膜间充质干细胞；第四，将分离的原始的人羊膜间充质干细胞重新悬浮于LG‑DMEM培养基中，将细胞密度接种于6孔培养板，置于CO2培养箱培养，在倒置显微镜下除去完全未贴壁生长的羊膜上皮细胞，第3天更换新的培养基；待细胞汇合度达80~90%后，用胰蛋白酶—EDTA溶液消化，加入培养基终止胰蛋白酶作用，离心弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮，以1×107/L的细胞密度传代。