[发明专利]一种基于非均等采样图像序列的定量数字相衬成像方法

摘要

一种基于非均等采样图像序列的定量数字相衬成像方法，它是在普通数字光学显微镜平台和普通个人用计算机上实现的。该方法有四大步骤：步骤一：光强度数据采集；步骤二：估计轴向强度导数；步骤三：用快速傅里叶变换方法求解光强传播方程；步骤四：定量相位成像。本发明不需要增加复杂的光学部件，基于多个非均等采样的错焦强度和相位恢复数值算法实现相位成像。本方法考虑到了错焦距离的误差对相位恢复精度的影响，便于实际应用。它可以用于提高透明或半透明相位样本成像的衬度，快速实现定量显微相衬成像和定量相位分析。本发明还适用于其他模态的显微成像系统，它在显微光学成像技术领域内具有广泛的实用价值和应用前景。

主权项

1.一种基于非均等采样图像序列的定量数字相衬成像方法，它是在普通数字光学显微镜平台和普通个人用计算机上实现的，其特征在于：该方法具体步骤如下：步骤一：光强度数据采集；在普通光学明场透射光学显微镜平台上，对厚度小于显微镜物镜景深的样本成像，采集焦平面和正负错焦平面上的多幅强度图像；焦平面的图像通过自动聚焦算法实现，错焦图像的记录通过载物台的移动实现，同时需要记录所有强度图像的错焦距离；这里定义I₀表示焦平面的图像，m＝1，2，..表示错焦平面上的图像，z_m表示错焦距离；这里，图像序列采用非均等采样方法获取；步骤二：估计轴向光强度导数；在显微镜中，假设样本处于空间坐标系(r，z)中，其中r＝(x，y)是平面x-y上的矢量，垂直于光轴Z；那么轴向光强度导数的表达式写成而在焦平面上光强度导数则表示成为了提高相位恢复精度，这里采用一种用多个非均等间隔采样的光强度估计高阶强度导数方法，具体叙述如下：首先，将焦平面z_m上的光强度I_z(r)在z＝0焦平面处做Taylor级数展开：Iz(r)-I0(r)=z∂I0(r)+Σn=2∞zn∂nI0(r)/n!,---(1)]]>其中n！表示n(n＝2，3，...，M)的阶乘，表示强度在焦平面的n阶轴向导数；对每幅错焦图像m＝1，2，..，上述方程都成立；于是得到：z1z12···z1Mz2z22···z2M············zMzM2···zMM∂I0(r)∂2I0(r)/2!···∂MI0(r)/M!=Iz1(r)-I0(r)Iz2(r)-I0(r)···IzM(r)-I0(r).---(2)]]>假设A表示如方程(2)所示的线性方程组的系数矩阵，B表示其逆矩阵；因为A是典型的范德蒙德矩阵，因此其逆矩阵B的表达式为：B＝[b]_M，bij=Σ1≤k1<...<kM-i≤Mk1,...kM-i≠j(-1)i-1zk1...zkM-i/[zjΠ1≤k≤Mk≠j(zk-zj)].---(3)]]>根据线性方程的求解原理，在方程(2)等式两边分别乘以矩阵B，得到方程(2)的解为：∂I0(r)∂2I0(r)/2!···∂MI0(r)/M!=BIz1(r)-I0(r)Iz2(r)-I0(r)···IzM(r)-I0(r).---(4)]]>根据方程(4)，得到方程(1)中的高阶轴向强度导数n＝2，3，...，M；从而得到轴向强度导数的估计式为∂I0(r)=Σm=1Mcm[Izm(r)-I0(r)].---(5)]]>cm=b1j=Σ1≤k1<...<kM-1≤Mk1,...kM-1≠mzk1...zkM-1/[zmΠ1≤k≤Mk≠m(zk-zm)],m=j.---(6)]]>当M＝2，3，4时c_m，m＝1，2，...，M的表达式如下列表所示：步骤三：利用快速傅里叶变换方法即FFT求解光强传播方程；在傍轴近似条件下，建立光强度传播方程并用FFT算法求解；先定义一些符号：λ表示波长；k＝2π/λ是波数；φ_z(r)为光的相位；是平面x-y上梯度算子；是平面x-y上的逆拉普拉斯算子；F[□]表示傅里叶变换；F^-1[□]表示逆傅里叶变换；q＝(q_x，q_y)表示与空间坐标r＝(x，y)相对应的空间频率；N表示图像中x或者y方向的像元个数，Δx＝Δy表示图像中每个像元的物理尺寸；在傍轴近似情况下，光强度传播方程表示为：设P是平面x-y中具有光滑边界的一个区域，假设在区域P内，I_z(r)＞0，同时假设φ_z(r)是连续的，那么在给定I_z(r)和时，TIE具有唯一解，即获取光强度沿光轴的变化率，通过求解TIE得到唯一的φ_z(r)；TIE的形式解写成如下形式：采用FFT方法求解此方程，由导数的傅里叶变换性质，即：∂xIz(r)=2πiF-1qxF[Iz(r)]]]>(9)∂yIz(r)=2πiF-1qyF[Iz(r)]]]>▿2Iz(r)=-4π2F-1(qx2+qy2)F[Iz(r)]=-4π2F-1q2F[Iz(r)]---(10)]]>得到：▿⊥-2Iz(r)=-14π2F-1q-2F[Iz(r)]---(11)]]>从而求得相位φ_z(r)的表达式为：φ_z＝φ_z⁽¹⁾+φ_z⁽²⁾φz(1)=14π2F-1q-2qxFI-1F-1qxq-2F[k∂zI]φz(2)=14π2F-1q-2qyFI-1F-1qyq-2F[k∂zI]---(12)]]>步骤四：定量相位成像；基于上述采集的多幅非均等间隔错焦图像，设计了一种高精度地计算强度在光轴方向的变化率的方法，利用FFT算法求解光强度传播方程(7)，实现定量相位成像；同时，采用均方根误差即RMSE衡量恢复相位的精度：RMSE=Σx,y(φ0′(x,y)-φ0(x,y)-a)2/(X×Y).---(13)]]>a=Σx,y(φ0′(x,y)-φ0(x,y))/(X×Y)]]>其中，X×Y为采集图像的像素个数，φ′₀(x，y)和φ₀(x，y)分别表示焦平面上估计的相位分布和真实相位分布。