[发明专利]猪体细胞的重组蛋白诱变方法

摘要

本发明公开了一种猪体细胞的重组蛋白诱变方法。其方法是构建细胞穿透肽外源限定因子的重组蛋白用于猪体细胞的诱导，从细菌中提取并纯化细胞穿透肽外源限定因子的重组蛋白，将限定因子重组蛋白添加到猪体细胞培养液中进行诱变，细胞穿透肽外源限定因子的重组蛋白能够进入猪体细胞中，在干细胞培养条件下能够逐渐形成集落边缘界限清晰的细胞集落，细胞集落中的单个细胞呈现圆形、细胞核较大且在细胞内所占比例较高，集落内细胞表达碱性磷酸酶和干细胞特异性分子标记Oct 4和Nanog。本发明证实限定因子重组蛋白能够使猪体细胞在形态、生长方式、基因表达等方面发生诱变作用。

主权项

一种猪体细胞的重组蛋白诱变方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)重组蛋白的制作使用的重组蛋白原核表达载体为pET‑28a‑EGFP，表达细胞为BL21大肠杆菌感受态细胞；采用9个精氨酸的细胞穿透肽分别介导外源限定基因oct4、sox2、klf4和myc，重组蛋白的基本组成形式为细胞穿透肽‑外源限定因子‑绿色荧光蛋白；将包含重组蛋白的原核表达载体转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，铺板、挑取单个菌落，在37℃摇床，含卡那霉素的细菌培养基中振荡培养过夜，然后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行诱导重组原核蛋白表达；诱导蛋白表达后收集菌体，重悬于冰浴预冷的结合缓冲液中，超声前加入终浓度为1mmol/L PMSF，冰上超声裂解细菌；裂解上清液经0.45μm滤膜过滤后装入有His‑Bind树脂的层析柱中，用漂洗缓冲液洗涤，洗脱缓冲液洗脱结合的重组蛋白，经0.22μm滤膜过滤除菌，‑20℃冻存备用；(2)重组蛋白的诱变当猪胎儿成纤维细胞生长汇合80％时进行传代，计数后将5×105个细胞接种于培养皿内，培养皿提前用0.1％明胶包被；第2d等量同时加入所述的oct4、sox2、klf4和myc限定因子的重组蛋白于猪胎儿成纤维细胞高糖DMEM培养液中，24h后更换为含4μg/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液，继续培养24h；此过程为1个周期，如此重复4‑6个周期；4‑6个周期后，将猪胎儿成纤维细胞用胰酶消化接种到小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，每个培养皿接种的细胞数约为1×105，继续用含4μg/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培养液培养；以后每天观察细胞变化，2‑3d换液1次，观察有无典型干细胞样克隆出现。