[发明专利]一种用于烟草花粉的高效诱变方法

摘要

本发明涉及一种用于烟草花粉的高效诱变方法。该方法是在无菌条件下获取烟草花粉并置于液体培养基中用浓度为0.1-0.2％的EMS在30-32℃的环境下避光诱变处理，再用NLN-16液体培养基在30-32℃避光环境下进行染色体加倍处理，之后置于NLN-13液体培养基中在24-26℃的环境下避光进行诱胚培养，待幼胚出现即可用24-26℃摇床避光振荡培养，最后出现子叶的胚置于固体培养基进行继代培养，移栽季节幼苗经炼苗后即可移栽入大田进行突变性状鉴定。本发明克服了基因表达上显隐性的障碍，有利于选择，且大大缩短了突变体性状稳定的周期，节省了育种时间；具有变异幅度大、诱变频率高等特点。

主权项

一种用于烟草花粉的高效诱变方法，其特征在于：所述方法依次按以下操作步骤进行：(1)样品采集：取烟株主花序或侧花序上健康的、花粉处于单核靠边期的适龄花蕾，迅速保存于冰盒；(2)消毒处理：在超净工作台上剥取花蕾中的花药，将取出的花药用无菌纱布或无菌市售丝袜装好浸入70 75％浓度的乙醇中消毒10 15s，再浸入饱和次氯酸钙溶液中浸泡8 10min，最后用无菌水漂洗多次；(3)收集花粉：将步骤2中消毒处理后的花药放入圆底试管中，加入1 3ml的B5 13液体培养基，再加入1 2ml用于软化花药壁的酶液，碾成匀浆，然后用装有300 400目双层尼龙膜的漏斗进行过滤，并用离心管收集滤液，离心处理后去上清液，加B5 13液体培养基重新悬浮，再次离心处理后去上清液；(4)诱变处理：将步骤3中经过两次离心处理后收集的花粉用B5 13液体培养基悬浮，加入浓度为0.1 0.2％的EMS溶液进行诱变处理，放入温度为30 32℃的环境下避光培养8 10h；(5)加倍处理：将步骤4中诱变处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清液8 10min，再用NLN 16液体培养基悬浮后转入玻璃容器中，放置在温度为30 32℃的环境避光培养50 70h，进行加倍处理；(6)诱胚培养：将步骤5中的加倍处理后的花粉溶液移入离心管中离心处理后去上清液，用NLN 13液体培养基悬浮花粉，转入培养皿中，放置在温度为24 26℃的环境下，进行避光诱胚培养14 21d，待培养皿中出现幼胚，便将培养皿放置转速为56 65r/min的摇床内，在温度为24 26℃环境下避光振荡培养6 8d；(7)继代培养：将步骤6中培养皿内出现子叶的胚转移到MS固体培养基上，在温度为25 27℃、日光照为8 10h的环境中进行继代培养；(8)幼苗转植：对步骤7中继代培养的幼苗进行炼苗，将通过炼苗后的幼苗根部的培养基清洗干净，移栽到温室的花钵中假植或者直接栽种于大田中进行突变体鉴定。