[发明专利]一种猪源链球菌的高密度培养方法

摘要

本发明公开了一种猪源链球菌的高密度培养方法，其步骤：（1）制备平板种子：将冻干保存的猪源链球菌野生种在TSA平皿上划线，培养，待长出单菌落后，再接种TSA平板，保存；（2）制备一级种子液：用接种环取一环的一级种子的单菌落，接种于TSB液体培养基中，培养，得到一级种子液；（3）制备二级种子液：取一级种子液接种量接入装有发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养，得到猪链球菌二级种子液；（4）上罐发酵；A、发酵液配制；B、接种及补料；C、发酵控制；D、发酵终点判断：当DO值重新由较低值回升到80%，放罐收菌。原料来源广泛、低廉，发酵快、产量高，提高猪链球菌菌体抗原的发酵水平，带来优质、价廉的猪链球菌疫苗产品。

主权项

一种猪源链球菌的高密度培养方法，其步骤是：（1）制备平板种子：将冻干保存的猪源链球菌TSA平皿上划线，置37℃培养16～24小时，待长出单菌落后，再接种TSA平板，置37℃培养14～16小时，2～8℃保存； （2）制备一级种子液：用接种环取一环步骤（1）的一级种子的单菌落，接种于TSB液体培养基中，置37℃摇床170rpm/min，培养5‑7小时，OD600达到0.4～0.6，得到一级种子液；（3）制备二级种子液：取步骤（2）的一级种子液以V/V计为1.5%的接种量接入装有200mL发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，控制摇床温度为37℃，转速为170rpm，起始pH为6.8‑7.5，发酵周期为4‑6小时，得到猪链球菌二级种子液；二级种子液配方：酵母粉25 g/L、胰蛋白胨25 g/L、硫酸镁0.3g/L、醋酸铵3 g/L调pH值达到7.1‑7.5，121℃灭菌20min，加入牛血清5%V/V，300g/L浓度葡萄糖1%、1M磷酸缓冲液5%(V/V；（4）上罐发酵：A、发酵液配制：酵母粉25 g/L、胰蛋白胨25 g/L、硫酸镁1.5 g/L、醋酸铵3 g/L，按50%~70%的装液量配制，加入0.01%体积的泡敌，用NaOH调pH至7.2‑7.6，121℃灭菌20min；B、接种及补料：按1%~3%V/V的接种量和5%~7%V/V的血清量将种子液和血清混合后，用补料泵打入发酵罐中，于接种后补600g/L浓度葡萄糖溶液，其流加手段包括：对数期一次流加发酵液终浓度为0.7%m/V葡萄糖、对数期分次流加终浓度为0.25%m/V葡萄糖、对数期连续流加葡萄糖溶液，维持糖质量浓度在0.05%~0.1%，其最优流加手段为对数期连续流加葡萄糖溶液，维持糖浓度在0.05%~0.1%；C、发酵控制：通过pH控制和DO控制维持菌体的对数生长，其pH控制手段有：初始磷酸缓冲液控pH值、在线流加NaOH溶液控pH值在6.7~7.3、在线流加氨水溶液控pH值在6.7~7.3，其中最优控制手段为在线流加氨水溶液控pH值在6.7~7.3；其DO控制手段：在对数生长期通过加速搅拌和提高通气量维持DO值在10%~30%；D、发酵终点判断：当DO值重新由较低值回升到80%，放罐收菌。