[发明专利]一种从人皮肤细胞直接诱导的神经元细胞及其制备方法

摘要

本发明属于生物医学领域，涉及一种从人皮肤细胞直接诱导的神经元细胞及其制备方法；本发明方法通过将包含重编程转录因子Sox2、Ascl1和Myt1l的cDNA导入离体成人皮肤细胞后，筛选表达人神经元细胞标记物的细胞克隆，直接制得能稳定传代的诱导型人神经元细胞。所述的神经元细胞具有以下特征：（1）在体外表达人神经元细胞特异性标志蛋白；（2）在体内可存活并发挥功能。本发明获得具有功能的人神经元细胞不需经过多能干细胞的过程，技术更简单有效；无异源饲养层参与，临床应用前景更好；采用的转录因子未见有致瘤相关报道，生物安全性更高。

主权项

一种从人皮肤细胞直接诱导神经元细胞的方法，其特征在于，将包含重编程转录因子Sox2、Ascl1和Myt1l 的cDNA导入成人皮肤细胞后，筛选表达人神经元细胞标记物的细胞克隆，直接制得能稳定传代的诱导型人神经元细胞；包括步骤：（1）收集和培养人皮肤细胞，所述的人皮肤细胞来源于离体的成人头皮组织：（2）筛选可促成人皮肤细胞转变为神经元细胞的关键诱导因子：从备选因子中：Ascl1、Brn2、Lhx2、Myt1l、Pax6、Sox2，经过不同组合的测试，找到关键因子组合：Sox2、Ascl1和Myt1l；（3）构建携带转录因子的慢病毒载体：分别将转录因子Sox2、Ascl1和Myt1l的cDNA连接到慢病毒穿梭质粒表达载体上；用293T细胞进行病毒包装和生产；用绿色荧光蛋白作为报告基因；（4）病毒感染离体成人皮肤细胞：采用步骤（3）所获得的病毒液，感染步骤（1）获得的成人皮肤细胞，培养1天后将细胞转置于不含病毒液的神经元细胞培养液中；（5）筛选表达人神经细胞标志蛋白的细胞克隆：挑选具有典型神经元形态的细胞，筛选出表达人神经细胞标志蛋白PSA‑NCAM的阳性细胞克隆。