[发明专利]分离差异表达基因未知序列的方法

摘要

本发明公开了一种分离与克隆差异表达功能基因未知序列的方法，采用多孔板或磁性微珠为载体，每个孔底部或磁株直接联接以化学合成方法连接多聚核糖核苷酸(PolydT)，比较细胞差异表达基因分析，采用Total RNA或mRNA加逆转录酶与缓冲液与PolydT在位合成cDNA，加热变性除去mRNA，然后再与进行比较分析的细胞Total RNA或mRNA杂交的方法，从而实现差异表达基因的分离与克隆，本方法综合了基因差减杂交方法与mRNA差异显示(DD)技术的原理，可以实现差异基因表达分析与克隆未知序列基因的技术芯片化。

主权项

一种分离差异表达基因的技术方法，其特征在于包括以下几个步骤：1）、将芯片或多孔板或微珠以化学方法连接多聚核糖核苷酸（Poly dT）；2）、常规提取2种或以上细胞的Total RNA或mRNA；3）、用一种Total RNA或mRNA与芯片或多孔板或磁珠上的多聚核糖核苷酸（Poly dT）在逆转录酶和缓冲液下合成单链cDNA；4）、加热变性，采用PBS缓冲液洗涤合成以上cDNA的RNA模板；5）、将另一种细胞的总RNA或mRNA与以上cDNA进行杂交；6）、用移液枪吸出留下未杂交的RNA到PCR反应的0.5ml离心管；7）、将离心管内的RNA加多聚核糖核苷酸（PolydT）、逆转录酶和缓冲液下合成单链cDNA；8）、以上7）合成的单链cDNA加热变性去除RNA模板后，进行常规方法的双链cDNA合成；9）、采用常规方法克隆双链cDNA，并进行序列测定。