[发明专利]一种人类松弛素-2 Relaxin的固相合成方法

摘要

本发明公开了一种人类松弛素-2的固相合成方法，包括以下步骤：1)单环A链的固相合成；2)B链的固相合成；3)人类松弛素-2的化学合成。采用本发明的方法生产人类松弛素-2，产率高，可达到74％-82％。本发明的方法生产步骤简便、生产过程中无杂质产生，有效地解决了人类松弛素-2的B链难以采用Fmoc策略完成固相合成并且合成工艺过于复杂的问题。

主权项

一种人类松弛素‑2的固相合成方法，其特征在于，包括以下步骤：1)单环A链的固相合成：a、将Wang树脂在二氯甲烷中溶胀，用N‑甲基吡咯酮洗涤树脂；b、以Wang树脂为载体，以由1‑氧‑3‑双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐、1‑羟基苯并三氮唑和N，N‑二异丙基乙胺三者按物质的量比1∶3∶1配制的混合液为偶联剂，以N，N‑二甲基甲酰胺为溶剂，进行程序反应，依次进行缩合反应连接Fmoc‑Cys(4‑MeBzl)‑OH、Fmoc‑Phe‑OH、Fmoc‑Arg(Pmc)‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Ser(Bzl)‑OH、Fmoc‑Arg(Pmc)‑OH、Fmoc‑Lys(Z)‑OH、Fmoc‑Thr(Bzl)‑OH、Fmoc‑Cys(Trt)‑OH、Fmoc‑Gly‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑His(Bum)‑OH、Fmoc‑Cys(Acm)‑OH、Fmoc‑Cys(Trt)‑OH、Fmoc‑Lys(Z)‑OH、Fmoc‑Asn(Tmob)‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Ser(Bzl)‑OH、Fmoc‑Tyr(Bzl)‑OH、Fmoc‑Leu‑OH和Fmoc‑pGlu‑OH，得pGlu‑Leu‑Tyr(Bzl)‑Ser(Bzl)‑Ala‑Leu‑Ala‑Asn(Tmob)‑Lys(Z)‑Cys(Trt)‑Cys(Acm)‑His(Bum)‑Val‑Gly‑Cys(Trt)‑Thr(Bzl)‑Lys(Z)‑Arg(Pmc)‑Ser(Bzl)‑Leu‑Ala‑Arg(Pmc)‑Phe‑Cys(4‑MeBzl)‑O‑树脂，其中每次缩合反应中Fmoc保护氨基酸的投料量与树脂用量的物质的量比为(1‑2)∶1，每次缩合反应中1‑氧‑3‑双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐用量与Fmoc保护氨基酸用量的物质的量比为1∶1；c、将pGlu‑Leu‑Tyr(Bzl)‑Ser(Bzl)‑Ala‑Leu‑Ala‑Asn(Tmob)‑Lys(Z)‑Cys(Trt)‑Cys(Acm)‑His(Bum)‑Val‑Gly‑Cys(Trt)‑Thr(Bzl)‑Lys(Z)‑Arg(Pmc)‑Ser(Bzl)‑Leu‑Ala‑Arg(Pmc)‑Phe‑Cys(4‑MeBzl)‑O‑树脂加入由溴化氢和乙酸按体积比3∶7配成的混合溶液中，室温下反应20分钟脱除Cys(Trt)的Trt保护基，将树脂抽干用二氯甲烷洗涤树脂后，将pGlu‑Leu‑Tyr(Bzl)‑Ser(Bzl)‑Ala‑Leu‑Ala‑Asn(Tmob)‑Lys(Z)‑Cys(Trt)‑Cys(Acm)‑His(Bum)‑Val‑Gly‑Cys(Trt)‑Thr(Bzl)‑Lys(Z)‑Arg(Pmc)‑Ser(Bzl)‑Leu‑Ala‑Arg(Pmc)‑Phe‑Cys(4‑MeBzl)‑O‑树脂加入由水、乙腈和二甲基亚砜按体积5∶4∶1配制的混合液，室温下搅拌4小时进行环化反应，其中溴化氢和乙酸的混合溶液用量为每克树脂使用4‑9ml，水、乙腈、二甲基亚砜混合液的用量为每克树脂使用5ml；d、保留Cys(4‑MeBzl)的4‑MeBzl保护基，脱除其他侧链保护基，将连接肽链的树脂加入由三氟乙酸、硫代苯甲醚、苯酚、二巯基乙醇和水按体积70∶8∶10∶5∶7配制的混合溶液，静置2小时，制成存在链内单环的A链；2)B链的固相合成：a、将Wang树脂在二氯甲烷中溶胀，用N‑甲基吡咯酮洗涤树脂；b、以Wang树脂为载体，以由1H‑苯并三唑‑1‑基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐、1‑羟基苯并三氮唑和1‑氧‑3‑双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐按物质的量比为1∶1∶4配制的的混合液物为偶联剂，以由盐酸胍、N，N‑二甲基甲酰胺和乙醇按质量比为6∶1∶7配制的混合溶液为溶剂，进行程序反应，依次进行缩合反应连接Fmoc‑Ser(Bzl)‑OH、Fmoc‑Trp(Boc)‑OH、Fmoc‑Thr(Bzl)‑OH、Fmoc‑Ser(Bzl)‑OH、Fmoc‑Met‑OH、Fmoc‑(Dmb)Gly‑OH、Fmoc‑Cys(4‑MeBzl)‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Gln‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Arg(Pmc)‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Arg(Pmc)‑OH、Fmoc‑(Dmb)Gly‑OH、Fmoc‑Cys(Acm)‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Lys(Z)‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Met‑OH、Fmoc‑Trp(Boc)‑OH、Fmoc‑Ser(Bzl)‑OH、Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH，得H‑Asp(OtBu)‑Ser(Bzl)‑Trp(Boc)‑Met‑Glu(OtBu)‑Glu(OtBu)‑Val‑Ile‑Lys(Z)‑Leu‑Cys(Acm)‑(Dmb)Gly‑Arg(Pmc)‑Glu(OtBu)‑Leu‑Val‑Arg(Pmc)‑Ala‑Gln‑Ile‑Ala‑Ile‑Cys(4‑MeBzl)‑(Dmb)Gly‑Met‑Ser(Bzl)‑Thr(Bzl)‑Trp(Boc)‑Ser(Bzl)‑O‑树脂，其中每次缩合反应中Fmoc保护氨基酸的投料量与树脂用量的物质的量比为(1‑4)∶1，每次缩合反应中1H‑苯并三唑‑1‑基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐用量与Fmoc保护氨基酸用量的物质的量比为1∶1；c、将H‑Asp(OtBu)‑Ser(Bzl)‑Trp(Boc)‑Met‑Glu(OtBu)‑Glu(OtBu)‑Val‑Ile‑Lys(Z)‑Leu‑Cys(Acm)‑(Dmb)Gly‑Arg(Pmc)‑Glu(OtBu)‑Leu‑Val‑Arg(Pmc)‑Ala‑Gln‑Ile‑Ala‑Ile‑Cys(4‑MeBzl)‑(Dmb)Gly‑Met‑Ser(Bzl)‑Thr(Bzl)‑Trp(Boc)‑Ser(Bzl)‑O‑树脂脱除部分保护基制成H‑Asp‑Ser‑Trp‑Met‑Glu‑Glu‑Val‑Ile‑Lys‑Leu‑Cys‑(Dmb)Gly‑Arg‑Glu‑Leu‑Val‑Arg‑Ala‑Gln‑Ile‑Ala‑Ile‑Cys(4‑MeBzl)‑(Dmb)Gly‑Met‑Ser‑Thr‑Trp‑Ser‑O‑树脂，然后将连接肽链的树脂加入由三氟乙酸、硫代苯甲醚、苯酚、二巯基乙醇和水按体积比为70∶8∶10∶5∶7配制的混合溶液，静置3小时，得H‑Asp‑Ser‑Trp‑Met‑Glu‑Glu‑Val‑Ile‑Lys‑Leu‑Cys‑(Dmb)Gly‑Arg‑Glu‑Leu‑Val‑Arg‑Ala‑Gln‑Ile‑Ala‑Ile‑Cys(4‑MeBzl)‑(Dmb)Gly‑Met‑Ser‑Thr‑Trp‑Ser‑OH；3)人类松弛素‑2的化学合成：将步骤1)与步骤2)制备的肽链按物质的量比为1∶1.2溶于由二甲基亚砜、N，N‑二甲基甲酰胺、三氟乙酸体积比1∶1∶3组成的溶剂系统搅拌均匀，室温静置1小时，然后匀速搅拌10小时，随后加入与溶剂系统中三氟乙酸等体积的二氯甲烷，室温静置1‑4小时，分离沉淀物，将沉淀物洗涤后溶于10mol/L的盐酸胍溶液，然后加入体积比为5∶95的三氟乙酸与水的混合溶液调节pH为3.0，用C18填料的半制备反相高效液相色谱柱纯化、洗脱、干燥即得。