[发明专利]一种提取糜胰蛋白酶的方法

摘要

本发明涉及生物工程领域，更具体地说涉及一种提取糜胰蛋白酶的方法。本发明采用CaCl2激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶的同时加入饱和度的(NH4)2SO4，使其生成CaSO4沉淀吸附糜胰蛋白酶，不需要先采用盐析多重结晶结合透析和乙醇及丙酮等的有机溶剂法制备成糜胰蛋白酶粗制品，再通过CM-纤维素柱层析和亲和层析等复杂步骤，进行纯化制备，而直接经过洗脱，盐析、超滤和冻干步骤即可获得白色的冻干粉末。本发明提取方法简便可行，适于工业化生产，这样既节省了成本又缩短了时间，由原来约需7～8天时间缩短到3～4天。每公斤胰脏可获得冻干糜胰蛋白酶粉4.0～4.5克，其中糜蛋白酶的比活力为360U./mg蛋白(氮)，胰蛋白酶的比活力为1380U./mg蛋白(氮)。

主权项

1.一种提取糜胰蛋白酶的方法，该方法有以下顺序步骤：a、以新鲜牛胰脏或猪胰脏或冷冻牛胰脏或冷冻猪胰脏为原料，除去脂肪和结缔组织，用清水洗净，再用绞肉机绞碎；b、将绞碎的胰脏移入不锈钢桶中，加入自来水，其比例为1∶4，用15％H₂SO₄溶液将其调节至PH值为3.0，在室温下不断搅拌24小时，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅰ和胰脏残渣沉淀物Ⅰ；c、将获得的浸取液Ⅰ倒入浸取液桶内备用，将胰脏残渣沉淀物Ⅰ用1∶2的比例加入PH值为3.0的自来水进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅱ和胰脏残渣沉淀物Ⅱ；d、将浸取液Ⅱ倒入浸取液桶内；将胰脏残渣沉淀物Ⅱ用1∶2的比例加入PH值为3.0的自来水进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅲ和胰脏残渣沉淀物Ⅲ；最后将浸取液Ⅲ倒入浸取液桶中与浸取液Ⅰ、Ⅱ合并，弃去胰脏残渣沉淀物Ⅲ；e、在浸取液桶中，加入25％～33％饱和度的(NH₄)₂SO₄搅拌均匀，静置2小时，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去杂蛋白沉淀，获得了清的浸取液；f、将获得清的浸取液中再加入65％～75％饱和度的(NH₄)₂SO₄，搅拌均匀，静置8～10小时，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后弃去浸取液，获得了糜胰蛋白酶原的沉淀；g、将获得的糜胰蛋白酶原的沉淀用PH值为3.0的去离子水溶解后，加入5％～7％CaCl₂，搅拌均匀，在4℃～5℃下，静置10小时，使Ca⁺⁺离子激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶；然后在糜胰蛋白酶溶液中加入20％饱和度的(NH₄)₂SO₄，搅拌均匀，加温至37℃，使溶液中Ca⁺⁺离子生成CaSO₄沉淀吸附溶液中的糜胰蛋白酶，静置10小时后，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后弃去上清液，收集CaSO₄沉淀；h、用去离子水对CaSO₄沉淀反复洗脱三次，洗脱液合并在一起，然后在洗脱液中加入65％～75％饱和度的(NH₄)₂SO₄，搅拌均匀，在4℃下静置10小时，再用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去上清液，得糜胰蛋白酶沉淀；最后用去离子水溶解后超滤，冷冻干燥，获得了白色的糜胰蛋白酶冻干粉末。