[发明专利]猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法

摘要

本发明公开了一种猪骨骼肌卫星细胞(Skeletal Muscle Satellite Cell，SMSC)体外培养方法，包括以下步骤：样品采集；培养皿的预处理；骨骼肌纤维的移植；单根肌纤维的移除；SMSC的传代培养；SMSC的鉴定；SMSC纯度检测；建立了一种简单易行、高纯度的猪SMSC体外培养方法，为SMSC介导的基因转移，肌肉组织再生和发育机理研究提供材料，同时为骨骼肌单根肌纤维或SMSC移植治疗肌相关疾病奠定基础。

主权项

一种猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，包括以下步骤：(1)样品采集用含0.5％的新洁尔灭清洗大白猪0.5h，电击处死；然后在无菌操作台上，在两端肌腱上操作，小心、完整剥离趾长伸肌，进一步剥离为四小块，以利于酶充分消化；(2)培养皿的预处理用基质胶涂布培养板，并将其置于37℃、5％CO2培养箱中4h以上；临用时，紫外灯照射30min后，用PBS洗涤备用；(3)骨骼肌纤维的移植将采集的趾长伸肌样品用PBS清洗2遍，加入等体积的Ⅰ型胶原酶，放入37℃水浴锅消化60‑90min后，转移至用马血清涂渍的玻璃皿中，用广口巴斯德吸管充分吹打，若吹打不开，则继续返回消化，直至有大量的单根肌纤维游离出来，选择完整未受损且呈光亮的单根肌纤维，用细口弯头吸管移入培养皿中清洗3次，以1根/孔的密度接种于24孔板中央，5min后，加入培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养，重复以上步骤，直至获得足够量的单根肌纤维为止；(4)单根肌纤维的移除培养3d后，用细口巴斯德吸管小心的将单根肌纤维吸出，以去除视野中的杂质；(5)SMSC的传代培养当细胞密度达到70％左右时，用0.25％的胰酶于37℃，5％CO2的培养箱中消化5min，然后用等体积的培养基终止消化，1500g离心7min，弃去上清液，重悬，红细胞计数器计数后，重新接种培养；(6)SMSC的鉴定；(7)SMSC纯度检测；其中所用培养基采用如下培养基：NaHCO3：2.3g/LHEPES：2.6g/LGibco胎牛血清：20％(体积百分比)Gibco马血清：10％(体积百分比)鸡胚提取物：1％青霉素：5×104U/L连霉素：5×104U/L三蒸水：80％(体积百分比)PH：7.2‑7.4。