[发明专利]一种高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法

摘要

本发明涉及一种高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法。用具体步骤如下：将实验动物打空气栓塞处死后经酒精浸泡15-20min消毒后，置入超净工作台内分离四肢骨，经PBS和DMEM培养液反复冲洗后，剪去骨两端，用含有肝素的DMEM液冲洗骨髓腔；肝素浓度为625U/ml；分别用不同直径大小的注射器针过滤步骤(1)中获取的骨髓液，制成单细胞悬液后缓慢注入含有等体积Percoll的离心管中，离心20分钟，收集中间云雾状细胞层，再以LG-DMEM液洗涤细胞，离心5min，重复洗涤2-3遍；将洗涤好的细胞加入含有适量比例双抗（1%）且包含10%胎牛血清的LG-DMEM液，吹打成细胞悬液，计数并调整细胞密度为1×108/L接种于25cm2塑料培养瓶中，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养。本发明能够简便有效的高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞，为进一步的基础实验以及临床研究做准备。

主权项

一种高效分离培养原代兔骨髓间充质干细胞的方法，其特征在于利用全骨髓冲洗手段，结合密度梯度离心与贴壁筛选培养方式体外分离培养4‑6周新西兰大白兔兔骨髓间充质干细胞，具体步骤如下： (1)全骨髓冲洗, 将实验动物打空气栓塞处死后经酒精浸泡15‑20min消毒后，置入超净工作台内分离四肢骨，经PBS和DMEM培养液反复冲洗后，剪去骨两端，用含有肝素的DMEM液冲洗骨髓腔；肝素浓度为625U/ml；(2)密度梯度离心方法，分别用不同直径大小的注射器针过滤步骤(1)中获取的骨髓液，制成单细胞悬液后缓慢注入含有等体积Percoll的离心管中，转速为2500r/min，离心20分钟，收集中间云雾状细胞层，再以LG‑DMEM液洗涤细胞，转速为1000r/min，离心5min，重复洗涤2‑3遍；(3)贴壁筛选培养方法，将步骤(2)中洗涤好的细胞加入含有适量比例双抗（1%）且包含10%胎牛血清的LG‑DMEM液，吹打成细胞悬液，计数并调整细胞密度为1×108/L接种于25cm2塑料培养瓶中，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养。