[发明专利]一种农杆菌介导的水稻活体转基因方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌介导的水稻活体转基因方法，其步骤：A、幼穗转化处理：利用分光光度计测定农杆菌浓度后，将农杆菌溶液用液体LB培养基稀释；B、转基因阳性苗的除草剂筛选：除草剂进行转基因阳性水稻的筛选，筛选时，将pCAMBIA3301-ubi转化处理所获得的种子催芽后，播种于营养钵中；C、转基因阳性株的检测PCR鉴定：筛选出的转基因水稻为阳性植株；D、转基因阳性株的GUS检测：取对照9311和转基因阳性植株的新鲜叶片直接浸泡在溶液中处理，GUS基因在转基因植株的叶片中表达，叶片被染色成深蓝色；转基因水稻中外源基因正常表达，证明其为阳性。本发明具有可行性，转化效率达0.33-1.59%，简便、实用，突破了水稻尤其是籼稻转基因操作的瓶颈，具有较强的应用价值。

主权项

一种农杆菌介导的水稻活体转基因方法，其步骤是：A、幼穗转化处理：利用分光光度计测定农杆菌浓度后，将农杆菌溶液用液体LB培养基稀释至OD600值0.3～0.6，然后按1ml分装在1.5ml离心管中备用；注射处理：选择减数分裂至四分体时期的幼穗，挂上标签，做好记号，注射时，首先注射器吸取1ml农杆菌，将注射器斜着从中上部插入，推动注射器，将农杆菌液注进穗腔，注射后，套袋、挂牌，并在标签牌注明品种、日期、浓度和发育时期，注射处理40～50天后，收获成熟稻穗；B、转基因阳性苗的除草剂筛选：转基因载体pCAMBIA3301‑ubi携带抗除草剂草胺磷基因，利用除草剂草胺磷筛选转基因阳性水稻，筛选时，将pCAMBIA3301‑ubi转化处理所获得的种子常规方法催芽后，播种于营养钵中，以非转基因9311为对照，苗期2叶1心时喷施浓度为50mg/l的Basta，连续喷施两天，每天一次，四天后，绝大部分植株变黄，一周后，除了阳性转基因幼苗仍然绿色外，其他的假阳性苗子全部枯死，将正常的抗性植株移栽至新的培养盆中，用于后续的分子检测；C、转基因阳性株的检测PCR鉴定：为了进一步验证抗除草剂筛选出的阳性植株，提取了其叶片的总DNA进行PCR检测，所设计的ubi引物ubi‑F: TGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC；ubi‑R: TTCTATCGCGGCTTAACGTAATTCA扩增出的目的片段大小为200bp，转基因植株中扩增出一条特异性、与目的带大小一致的200bp条带，筛选出的转基因水稻为阳性植株；D、转基因阳性株的GUS检测：为了更进一步鉴定外源基因在受体植株中正常表达，采用组织化学染色法分析了GUS基因在转基因植株中的表达，取对照9311和转基因阳性植株的新鲜叶片直接浸泡在0.5 mg/ml的X‑Gluc：5‑溴‑4氯‑3‑吲哚葡萄糖苷溶液中处理3h，观察转基因植株中GUS基因在水稻中的表达，染色结果显示，GUS基因在转基因植株的叶片中表达，叶片被染色成深蓝色；对照9311的叶片为浅色，和阳性水稻形成鲜明的对照，转基因水稻中外源基因正常表达，进一步证明为阳性。