[发明专利]一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒

摘要

本发明涉及一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒，是由以下方法完成，包括细菌沉淀、非碱裂解、硅胶膜结合环状DNA、洗柱、洗脱，是在上述方法的基础上增加了六氨合高钴和精胺成份，采用改良的非碱裂解液裂解细菌、通过多胺选择性地使线状的基因组DNA和RNA发生高度浓缩而丧失与硅胶膜结合的能力，仍然能够与硅胶膜结合，经过洗涤和洗脱就可以达到快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒，本发明DNA纯化技术代替了两步式DNA纯化技术，完全省略了质粒粗提步骤，不依赖于大肠杆菌的种类对操作剧烈程度不敏感，步骤少，缩短质粒DNA纯化操作时间，节约人力、物力，适合于高通量质粒DNA纯化和工业级大规模质粒DNA纯化技术使用。

主权项

一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒，其特征在于：它是由下述步骤和方法完成的，具体步骤方法如下，共价闭合环状DNA纯化技术步骤如下：第一步：细菌沉淀，由于细菌体积在10‑50L，主要用过滤法收集细菌沉淀，去掉液体培养基，得到菌体；第二步：非碱裂解，用非碱裂解液裂解细菌，其间需要使用大型搅拌器进行充分搅拌，使细菌裂解，同时多胺使基因组DNA和RNA发生高度浓缩而失去与硅胶膜结合的能力，我们对非碱裂解液配方进行了优化，增加了精胺和六氨合高钴两种成份；第三步：硅胶膜结合环状DNA，使用上步所得裂解液直接上柱，裂解液直接用硅胶吸附法进行质粒DNA纯化，除质粒DNA外，蛋白质和呈紧密团状的基因组DNA和RNA都将不能与硅胶膜结合而进入穿透液；第四步：洗柱，洗去硅胶膜上残留的蛋白质、部分RNA和小分子杂质，用常规的洗柱液洗柱，为尽量去除杂质，可能需要多次重复此步骤；第五步：洗脱，用低盐溶液将质粒DNA从硅胶膜上洗脱下来待用；用低盐的溶液“如TE或超纯水”将硅胶膜结合的质粒DNA洗脱，共价闭合环状DNA纯化技术方法如下：1)细菌沉淀，菌体收集：用塑料离心管收集不超过3mL过夜培养饱和菌液，室温12000‑15000g离心半分钟，弃上清；2)非碱裂解，裂解菌体：加入0.6‑1mL裂解液“用前需摇匀”，充分吹打或振荡裂解细菌直到裂解变澄清，通常需要半分钟；菌液离心后加入六氨合高钴和精胺，六氨合高钴的终浓度为25mM，精胺的终浓度为75mM；3)硅胶膜结合环状DNA，结合DNA：将裂解液全部转移到离心吸附柱中，室温静置2分钟使质粒DNA与膜结合，室温12000‑15000g离心半分钟，弃穿透液，如果一次不能将上清全部转移到离心吸附柱中，分两次进行；4)洗柱，预洗：在离心吸附柱中加入0.7mL的预洗液，室温12000‑15000g离心半分钟，弃穿透液，如果预洗液放置在低温产生了沉淀，用前需要加热到60℃使之融化，混匀后再用；5)洗脱，再预洗：再在离心吸附柱中加入0.3mL的预洗液，室温12000‑15000g离心半分钟，弃穿透液，此步预洗最好别省略，否则DNA纯度不高；清洗：在离心吸附柱中加入0.7mL的洗柱液，室温12000‑15000g离心半分钟，弃穿透液；再清洗：再在离心吸附柱中加入0.3mL的洗柱液，室温12000‑15000g离心半分钟，弃穿透液，室温12000‑15000g离心半分钟，甩干残留液体；洗脱：将离心柱置于一个新的1.5mL自备塑料离心管中，加入30‑100uL DNA洗脱液，室温放置2分钟，如果将DNA洗脱液预热到65‑80℃，既得本发明一种快速共价闭合环状DNA纯化试剂盒。