[发明专利]一种蛇足石杉组织培养的方法

摘要

本发明公开了一种蛇足石杉组织培养的方法。该方法包括选择外植体、杀灭表面菌、接种培养、杀灭内生菌、扩繁培养和生根培养操作步骤。蛇足石杉是一种珍贵的药用蕨类植物，对生境要求苛刻，在自然条件下生长缓慢、生产周期长，常规方法繁殖系数和生物量低，无法满足药品生产的需要。本发明使蛇足石杉试管苗的分化率达到90％，月增殖倍数达2.1-3.5，生根率达到100％，根系生长快且生根数达1.6-3.4/株，再生苗生长健壮且根系较发达。本发明方法简便易行，效率高，有效地抑制了蛇足石杉外植体的污染和褐化，促进了外植体的存活生长，成本低，为实现蛇足石杉的人工大量栽培提供了重要的技术支持。

主权项

一种蛇足石杉组织培养的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)选择外植体从野外采集蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb.)Trev.]的孢子体，切取茎尖，经自来水冲洗干净；(2)杀灭表面菌将洗净的茎尖在超净台中先浸入浓度70％的乙醇溶液30‑50s；接着置于浓度0.1％的升汞(HgCl2)溶液浸泡7‑10min，再转入浓度7％的双氧水(H2O2)溶液中浸泡10‑15min，最后用无菌水冲洗3‑5次，作为蛇足石杉组织培养的外植体；(3)接种培养将所述外植体接种在促进茎尖生长的改良MS培养基上，置于22‑27℃、光照时间12‑14h/d、光照强度800‑2000lx条件下进行培养2‑3周；(4)杀灭内生菌将接种培养后的外植体转至含孔雀石绿和抗生素AAS的改良MS培养基上，继续培养2‑3周，培养条件同步骤(3)；对内生菌进行杀灭。(5)扩繁培养将步骤(4)经内生菌杀灭后无菌的外植体转入丛生芽分化扩繁的改良MS培养基继续培养一段时间，当茎尖顶芽长到5‑8mm后，切取新长出的外植体顶芽约3‑5mm转接到丛生芽分化扩繁的改良MS培养基中进行组培苗的分化和增殖培养，培养条件同步骤(3)，从组培苗茎基部分化产生出丛生苗；(6)生根培养切取步骤(5)中从组培苗茎基部分化产生的丛生苗转至生根培养基中，置于培养室进行生根培养，培养条件同步骤(3)；所述改良MS培养基由下列物质组成：950mg/L硝酸钾(KNO3)、825mg/L硝酸铵(NH4NO3)、185mg/L硫酸镁(MgSO4·7H2O)、220mg/L氯化钙(CaCl2·2H2O)、85mg/L磷酸二氢钾(KH2PO4)、8.45mg/L硫酸锰(MnSO4·H2O)、4.3mg/L硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、3.1mg/L硼酸(H3BO3)、0.415mg/L碘化钾(KI)、0.125mg/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、0.025mg/L硫酸铜(CuSO4·5H2O)、0.025mg/L氯化钴(CoCl2·6H2O)、50mg/L肌醇、1mg/L甘氨酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇(VB6)、0.5mg/L烟酸(VB5)、0.1mg/L盐酸硫胺素(VB1)、9.31mg/L乙二胺四乙酸二钠(Na2‑EDTA·2H2O)、6.96mg/L硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、30g/L蔗糖、5.6g/L琼脂；所述含孔雀石绿和抗生素AAS的改良MS培养基由下列物质组成：在改良MS培养基中加入100mg/L抗生素(AAS)和0.5mg/L孔雀石绿；所述丛生芽分化扩繁的改良MS培养基由下列物质组成：在改良MS培养基中加入2μmol/L 6‑苄氨基嘌呤(6‑BA)；所述生根培养基由下列物质组成：在改良MS培养基中加入10μmol/L 3‑吲哚丁酸(IBA)。