[发明专利]海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法

摘要

本发明公开了一种海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法，步骤为：a)海洋球石藻病毒的纯化与浓缩；b)设计引物；c)提取DNA；d)PCR扩增海洋球石藻病毒EhV外壳蛋白基因；e)PCR电泳回收产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取克隆，提取质粒进行酶切后电泳分析PCR产物并进行测序鉴定；f)通过双酶切得到目的基因片断，连接质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选得到重组载体；g)目的基因的小量表达；h)大量表达；i)SDS-PAGE鉴定蛋白表达量。本发明获得了大量纯化的重组病毒外壳蛋白，下一步可用于免疫生产抗体，为建立快速、准确检测球石藻病毒感染导致的宿主细胞裂解率的免疫荧光检测技术提供了物质基础。

主权项

一种海洋球石藻病毒外壳重组蛋白原核表达的制备方法，其特征在于包括如下步骤：a)海洋球石藻病毒EhV与宿主之间稳定感染体系的建立，病毒感染90小时后取病毒裂解上清液进行病毒的纯化与浓缩；b)根据海洋球石藻病毒EhV外壳蛋白基因的全长序列设计引物；c)从步骤a)中已提纯的海洋球石藻病毒EhV中提取DNA；d)PCR扩增海洋球石藻病毒EhV外壳蛋白基因；e)PCR电泳回收产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取克隆，提取质粒采用EcoR I和Not I进行双酶切后电泳分析PCR产物并进行测序鉴定，海洋球石藻病毒外壳重组蛋白基因测序结果见序列表1。f)选择与预期大小相符的条带进行回收，通过双酶切得到目的基因片断，连接质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选得到重组载体；g)将构建好的重组载体转化入大肠杆菌表达菌株内，挑取单克隆进行目的基因的小量表达；h)挑取单克隆进行目的基因的大量表达；i)将诱导前的样品、诱导后及纯化后的样品进行SDS‑PAGE鉴定蛋白表达量。