[发明专利]条斑星鲽精子冷冻保存方法

摘要

一种简单实用的条斑星鲽精子冷冻保存的新方法，包括精液采集、基础液选择、抗冻剂选择、精子稀释与平衡、精子冷冻、精子复苏、精子复苏后受精效果检验。本发明是选取性成熟的亲鱼采集优质精液，选择适宜基础液及抗冻液，精液与基础液按照体积比1∶2混合后，冰上或者4℃平衡5min，按照三步降温法降温至-160℃后停留5min，直接投入液氮中保存；解冻时，将冷冻管在液氮蒸汽中停留3min，迅速投入28℃水浴解冻60s后置于室温下完全溶解，获得可用于规模化苗种繁育所需的大批量的高质量精液。本发明简单易行实用，精液保存解冻后活动率高、受精效果好，平均受精率可达到70％以上，孵化率达到50％以上，与新鲜精液的受精效果和孵化效果相同。为苗种繁育企业规模化育苗，提供了容易操作的精液长期或短期保存技术。

主权项

一种条斑星鲽精子冷冻保存方法，其特征在于它的方法内容包括：(1)、精液采集，(2)、基础液选择，(3)、抗冻剂选择，(4)、精子的稀释与平衡，(5)、精子冷冻，(6)、精子复苏，(7)、冻精复苏后的受精效果检验；(1)、精液采集：选择性腺发育成熟的雄性亲鱼，利用150mg/L的MS222麻醉后，采用腹部挤压法获取精液，以吸管和干燥的1.5ml离心管收集精液，精液采集后置于冰上保存，活动率85％以上的精液样品用于精子冷冻；(2)、基础液选择：选用Hank`s液作为基础液，配制方法：CaCl2·2H2O0.185g/L，无水MgSO40.09767g/L，KCl 0.4g/L，Na2HPO40.06g/L，NaCl 8g/L，NaH2PO4 0.04788g/L，D-葡萄糖1g/L，NaHCO30.35g/L，以1N HCL调节pH至7.6，备用；(3)、抗冻剂选择：以基础液终浓度的百分比15％DMSO+10％蛋黄作为抗冻保护剂；(4)、精子的稀释与平衡：将精液与预冷的4℃稀释液按照体积比1∶2混合，然后按照要求的体积比加入抗冻剂，在冰上或4℃冰箱平衡4-6min；(5)、精子冷冻：将平衡后的精液和稀释液混合液按照每管1.8ml分装入2ml冻存管中，按照三步降温法进行冷冻保存；即液氮罐颈部约-15℃停留2min；液氮面上约4cm处约-160℃停留5min；再直接投入液氮中保存；(6)、精子复苏：解冻时，先将冻存管提至罐口，在液氮蒸汽中停留约3min，然后将冷冻管取出迅速置于28℃水浴中解冻60s，管中冻精外层开始融化，取出置于室温下至完全融化；在室温条件下，以自然海水激活精子，检查精子活力；(7)、冻精复苏后的受精效果检验：人工采集成熟条斑星鲽卵子，以新鲜精液和解冻后复苏精液分别进行人工授精；将受精卵置于循环流水孵化系统进行孵化，统计受精率和孵化率。