[发明专利]一种mRNA定量检测方法

摘要

本发明公开了一种mRNA定量检测方法。该方法首先通过光学薄膜生物感应器芯片准备、探针合成及点阵、标准mRNA色版样品准备、cDNA合成及DIG标记、杂交、沉淀反应及显色制备出标准mRNA色版；然后通过光学薄膜生物感应器芯片准备、探针合成及点阵、样品总RNA提取、cDNA合成及DIG标记、杂交、沉淀反应及显色制备出被检测样品，用样品的mRNA与标准mRNA呈现的颜色进行比色而确定被检测样品中mRNA的含量。本发明提供的方法检测精度高，比琼脂糖变性胶检测方法的精度提高十万倍；检测速度快，所用时间短，只需30分钟便可检测出结果，比Northern杂交检测方法用时少10小时以上；检测结果可直接肉眼识别读取，无需使用仪器设备；应用前景广，可普遍用于生物的mRNA定量检测。

主权项

一种mRNA定量检测方法，其特征在于如下步骤：步骤一、光学薄膜生物感应器芯片准备；所述的光学薄膜生物感应器芯片为硅材质光学薄膜生物感应器芯片，芯片分为三层，从下到上依次为硅支持层、光反射层、表面附着层；步骤二、探针合成及点阵；探针为oligo dA20，其5′端含有醛基；用移液器或点样仪，将探针在芯片上进行点阵；步骤三、标准mRNA色版样品准备；标准mRNA为neo poly(A)″Sense″RNA，浓度为200ug/ml，制作成含量为1ng到500ng共500个浓度梯度的标准样品，用以制作标准色版；步骤四、cDNA合成及DIG标记；用反转录酶和dNTPs，将标准mRNA进行反转录，合成带有DIG标注的cDNA；步骤五、杂交；将cDNA加入杂交缓冲液中，再将芯片置于杂交缓冲液中，在45℃下10分钟；室温下用0.1xSSC中清洗3次，吹干待用；步骤六、沉淀反应及显色；室温下将芯片置于杂交缓冲液中，加入anti-DIG-AP，温育10分钟；用0.1xSSC冲洗芯片3次，再将芯片置于AP缓冲液中，温育5分钟；取出芯片，再将芯片置于100ml的NBT/BCIP中，在室温条件下，避光温育5分钟，用ddH2O冲洗芯片3次，晾干；步骤七、将标准mRNA获得的颜色梯度制作成标准色版，每100ul中，含量从1ngl到500ng，共500个含量值的标准色块；步骤八、定量检测；(a)按照步骤一和步骤二准备光学薄膜生物传感器芯片并进行探针合成及点阵；(b)总RNA提取：将所要检测的样品用Trizol试剂提取总RNA，利用分光光度检测方法检测样品中总RNA的含量，用以初步判断RNA的提取量；(c)cDNA合成及DIG标记：用反转录酶和dNTPs，将总RNA进行反转录，合成带有DIG标注的cDNA；(d)按照步骤五和步骤六进行杂交、沉淀反应及显色；(e)比色：将样品提取总RNA所获得的样点颜色与标准色版的样点颜色进行比对，直接比色观察或显微镜照相后在电脑上比色观察均可，在标准色版上与检测样点颜色一致的色块所对应的mRNA含量值就是被检测样品的mRNA含量值。