[发明专利]一种牛诱导性多能干细胞诱导方法

摘要

本发明公开了一种牛诱导性多能干细胞诱导方法，利用外源限定因子与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)报告基因构建融合蛋白慢病毒表达载体用于牛诱导性多能干细胞的诱导，对表达外源限定因子融合蛋白的牛胎儿成纤维细胞进行培养传代，逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆，细胞集落生长状态稳定，核型正常，碱性磷酸酶检测为阳性，免疫细胞化学检测显示Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性，体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤，结果证实分离培养的细胞克隆具有胚胎干细胞样特征，得到牛诱导性多能干细胞。

主权项

一种牛诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、限定因子慢病毒表达载体的构建：根据猪Sox2、c‑Myc、K1f4基因的mRNA序列和人Oct4的DNA序列，设计合成出pSox2、pK1f4、pc‑Myc、hOct4基因的上、下游引物；从猪囊胚中提取总RNA，利用设计合成出的pSox2、pK1f4和pc‑Myc基因的上、下游引物经RT‑PCR扩增出猪限定基因DNA，人Oct4的DNA序列经hOct4基因的上、下游引物直接从人Oct4基因中扩增获取，将猪限定基因DNA和人Oct4的DNA序列进行酶切，然后与逆转录病毒载体pLEGFP‑N1连接，构建出逆转录病毒融合蛋白表达载体，从逆转录病毒融合蛋白表达载体中扩增出CMV启动子连同限定基因及EGFP基因，同时通过酶切从pLL3.7质粒中移除U6启动子、CMV启动子和GFP序列，最后把CMV启动子连同限定基因及EGFP基因与酶切后的pLL3.7进行重组，构建出慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体；所述的pSox2、pK1f4、pc‑Myc、hOct4基因的上、下游引物序列为：pSox2上游：5’‑TTTAAGCTTGCCACCATGTACAACATGATGGAGAC‑3’；下游：5’‑AAAGGATCCGGCATGTGAGAGAGAGGCAGTGTAC‑3’；pK1f4上游：5’‑TATAAGCTTGCCACCATGGCTGTCAGCGACGCAC‑3’；下游：5’‑GGCGGATCCGGAAAATGCCTCTTCATGTGTAAGGC‑3’；pc‑Myc上游：5’‑GCCAAGCTTGCCACCCTGGATTTCCTTCGGATAG‑3’；下游：5’‑AAAGGATCCGCTGGGCAAGAGTTCCGTAGCTG‑3’；hOct4上游：5’‑AATGTCGACGCCACCATGGCGGGACACCTGGCTTC‑3’；下游：5’‑CGCGGATCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC‑3’。(2)、牛胎儿成纤维细胞的诱导：采用组织块培养法建立牛胎儿成纤维细胞系，采用磷酸钙法转染慢病毒限定基因融合蛋白重构表达载体的四因子质粒PLL‑hOCT4/pSOX2/pMYC/pKLF4，同时将慢病毒包装产生病毒需要的辅助质粒pMDLg、pRSV REV和pVSVg包装到293T细胞，12‑16h后换293T细胞新鲜培养液，病毒包装48h后收集含病毒培养液，经超滤浓缩后添加到含有牛胎儿成纤维细胞培养板内，感染18‑20天后，细胞出现初步形态变化后将感染的细胞经Dispase II消化，接种至丝裂霉素C处理过的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上进行培养，感染23‑25天后，牛胚胎干细胞样克隆明显可见。