[发明专利]一种无氧环境中分离纯化绿藻氢酶的方法

摘要

本发明涉及一种绿藻氢酶分离纯化的方法。该方法始终在无氧环境中进行，采用无氧操作袋与层析柱串联系统。将试剂、器皿放入无氧操作袋中，所有试剂均加入连二亚硫酸钠以除去溶氧，用高速珠磨法破碎绿藻细胞，粗酶液经硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和离子交换层析纯化后，获得纯氢酶，经SDS-PAGE检测显示单一条带。国外相似方法是将所有用到的仪器、装置放入巨大的无氧装置中，占地面积大，保护气成本高，且操作困难；国内尚无相关技术报道。本发明将无氧操作袋与层析柱串联起来，操作简单易行，且成本较低。

主权项

一种绿藻氢酶分离纯化的方法，其特征在于：此分离纯化过程始终在无氧环境中进行，采用无氧操作袋与层析柱串联系统，将试剂、器皿放入无氧操作袋中，层析柱置于无氧操作袋外部，无氧操作袋与层析柱通过管路串联；具体操作步骤如下：1)取生长对数后期，鲜重为10g绿藻藻细胞，重新悬浮于50‑200mL灭菌海水或磷酸缓冲液中，得藻液，置于密闭玻璃瓶中；通氮气5‑15min，排除玻璃瓶中氧气后，在黑暗中诱导3‑12h；2)取玻璃瓶于无氧操作袋中，反复充N2抽真空2‑6次后，将藻液分装于密封离心管中，离心浓缩，去上清后重悬于10‑15mL Tris‑Hcl缓冲液中；在重悬液中加入5‑15g、‑20‑4℃预冷玻璃珠，用涡旋震荡器混旋3‑5次破碎绿藻细胞，每次1‑2min，两次之间在冰上静置1‑2min，然后在0‑4℃下离心，取上清弃沉淀；3)将10‑15mL上清液用Tris‑Hcl缓冲液稀释至15‑30mL，缓慢加固体(NH4)2SO4沉淀蛋白，在0‑4℃下离心，取上清弃沉淀；4)在步骤(3)离心后获取的上清液中缓慢加入固体(NH4)2SO4沉淀蛋白，在0‑4℃下离心，收集沉降下的蛋白，重新悬浮于4‑8mL Tris‑Hcl缓冲液中；以上步骤2)‑4)均于无氧操作袋中进行，所用试剂、器皿均放入无氧操作袋中；5)将4‑8mL酶液用蠕动泵打入填装有Sephacryl S‑100HR的凝胶过滤层析柱中，用150‑300mL Tris‑Hcl缓冲液冲洗，采用气相色谱检测有氢酶活性的组分；6)将步骤(5)中的有氢酶活性的组分用蠕动泵打入填装有DEAE‑Sehparose CL‑6B的离子交换层析柱中，用200‑400mL Tris‑Hcl缓冲液冲洗，采用气相色谱检测收集有氢酶活性的组分，即纯绿藻氢酶。