[发明专利]诱导马尾松未成熟种子胚性胚柄细胞团再生植株的方法有效
| 申请号： | 201010109751.9 | 申请日： | 2010-02-10 |
| 公开（公告）号： | CN101849505A | 公开（公告）日： | 2010-10-06 |
| 发明（设计）人： | 施季森;高燕;席梦利;边黎明;陈金慧;郑仁华;黄寿先 | 申请（专利权）人： | 南京林业大学 |
| 主分类号： | A01H4/00 | 分类号： | A01H4/00 |
| 代理公司： | 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 | 代理人： | 唐建清 |
| 地址： | 210037 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 一种诱导马尾松未成熟种子ESM再生植株的方法，利用马尾松未成熟种子ESM所具有的持续裂生能力特征，通过固体和液体培养的交替培养，经过维持、增殖、体胚成熟前期、成熟培养四个阶段，使ESM形成发育完整、结构正常的体胚，经萌发培养获得马尾松植株。采用本发明所提供的方法，可以获得大量遗传基础一致的马尾松体胚的再生植株，为马尾松珍稀遗传资源的保存、优良基因型苗木的大量生产，提供了一种周期短、发生效率高的新技术。 | ||
| 搜索关键词： | 诱导 马尾松 未成熟 种子 胚性胚柄 细胞 再生 植株 方法 | ||
【主权项】：
一种诱导马尾松未成熟种子胚性胚柄细胞团再生植株的方法，其特征是在每年的6月中旬采集马尾松优树球果，置于4℃冷藏保存预处理一周以上后，在无菌条件下剥取球果中的未成熟胚，按以下培养条件和先后时间顺序培养：a.ESM的起始诱导在无菌条件下将未成熟种子胚接种至下述诱导培养基中，在23℃的温度下暗培养40天，诱导获得大量ESM，培养基配方如下：KNO3 340mg/LCa(NO3)2·4H2O 56mg/LNH4NO3 400mg/LKH2PO4 170mg/LCaCl2·2H2O 85mg/LMgSO4·7H2O 370mg/LNa2-EDTA·H2O 37.3mg/LFeSO4·7H2O 27.8mg/LH3BO3 6.2mg/LMnSO4·H2O 22.3mg/LZnSO4·7H2O 8.6mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25mg/LCuSO4·5H2O 0.25mg/LKI 0.83mg/LCoCl2 0.025mg/LNiCl2 0.025mg/LMyO-Inositol 200mg/LGlycine 2.0mg/LThiamine·HCI 1.0mg/LNictinic·acid 0.5mg/LPyridoxine·HCI 0.5mg/L2，4-D 2mg/L6-BA 1mg/L谷氨酰胺 1g/L水解酪蛋白 0.5g/L肌醇 1g/L糖 30g/L琼脂 1.9g/Lb.EMS的维持与增殖将a.中所诱导培养所得的EMS在无菌条件下转入以下配方培养基中，在23℃、暗培养条件下，维持培养20天：KNO3 340mg/LCa(NO3)2·4H2O 556mg/LNH4NO3 400mg/LKH2PO4 170mg/LCaCl2·2H2O 85mg/LMgSO4·7H2O 370mg/LNa2-EDTA·H2O 37.3mg/LFeSO4·7H2O 27.8mg/LH3BO3 6.2mg/LMnSO4·H2O 22.3mg/LZnSO4·7H2O 8.6mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25mg/LCuSO4·5H2O 0.25mg/LKI 0.83mg/LCoCl2 0.025mg/LNiCl2 0.025mg/LMyO-Inositol 200mg/LGlycine 2.0mg/LThiamine·HCI 1.0mg/LNictinic·acid 0.5mg/LPyridoxine·HCI 0.5mg/L2，4-D 0.6mg/L6-BA 0.2mg/L谷氨酰胺 1g/L水解酪蛋白 0.5g/L肌醇 1g/L糖 30g/L琼脂 7.0g/L将维持培养20天后的EMS移入以下液体培养基中，在23℃、暗培养，摇床转速为80～100r.p.m的条件下增殖培养7天：KNO3 340mg/LCa(NO3)2·4H2O 556mg/LNH4NO3 400mg/LKH2PO4 170mg/LCaCl2·2H2O 85mg/LMgSO4·7H2O 370mg/LNa2-EDTA·H2O 37.3mg/LFeSO4·7H2O 27.8mg/LH3BO3 6.2mg/LMnSO4·H2O 22.3mg/LZnSO4·7H2O 8.6mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25mg/LCuSO4·5H2O 0.25mg/LKI 0.83mg/LCoCl2 0.025mg/LNiCl2 0.025mg/LMyO-Inositol 200mg/LGlycine 2.0mg/LThiamine·HCI 1.0mg/LNictinic·acid 0.5mg/LPyridoxine·HCI 0.5mg/L2，4-D 0.6mg/L6-BA 0.2mg/L谷氨酰胺 1g/L水解酪蛋白 0.5g/L肌醇 1g/L糖 30g/Lc.体胚的成熟前期培养将b.中所增殖培养完成后的EMS转移到以下配方液体培养基中，在23℃、暗培养，摇床转速为80～100r.p.m的条件下，成熟前期培养7天：KNO3 909.9mg/LCa(NO3)2·4H2O 236.2mg/LNH4NO3 603.8mg/LKH2PO4 136.1mg/LMg(NO3)2·6H2O 256.6mg/LMgSO4·7H2O 246.5mg/LMgCl2·6H2O 50.0mg/LNa2-EDTA·H2O 9.33mg/LFeSO4·7H2O 6.95mg/LH3BO3 15.5mg/LMnSO4·H2O 10.5mg/LZnSO4·7H2O 14.4mg/LNa2MoO4·2H2O 0.125mg/LCuSO4·5H2O 0.125mg/LKI 4.15mg/LCoCl2 0.125mg/LMyO-Inositol 1000mg/LGlycine 2.0mg/LThiamine·HCI 1.0mg/LNictinic·acid 0.5mg/LPyridoxine·HCI 0.5mg/LABA 5mg/Ld.体胚的成熟培养将c.中经成熟前期培养的材料转移到以下培养基中，在23℃的温度下暗培养40天：KNO3 909.9mg/LCa(NO3)2·4H2O 236.2mg/LNH4NO3 603.8mg/LKH2PO4 136.1mg/LMg(NO3)2·6H2O 256.6mg/LMgSO4·7H2O 246.5mg/LMgCl2·6H2O 50.0mg/LNa2-EDTA·H2O 9.33mg/LFeSO4·7H2O 6.95mg/LH3BO3 15.5mg/LMnSO4·H2O 10.5mg/LZnSO4·7H2O 14.4mg/LNa2MoO4·2H2O 0.125mg/LCuSO4·5H2O 0.125mg/LKI 4.15mg/LCoCl2 0.125mg/LMyO-Inositol 1000mg/LGlycine 2.0mg/LThiamine·HCI 1.0mg/LNictinic·acid 0.5mg/LPyridoxine·HCI 0.5mg/LABA 2mg/LGA3 1mg/L活性炭 1g/LPEG8000 130g/L糖 25g/L谷氨酰胺 1g/L琼脂 7g/L当具子叶的体胚生长发育到约2mm左右长度时，采用改良P6基本培养基进行培养萌发，即可实现植株的再生和培育成苗。
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