[发明专利]CAST基因与OB基因双酶切方法的建立及其在猪聚合育种中的应用

摘要

本发明属于动物基因工程技术领域，研究两个影响肉质性状的候选基因即钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因和肥胖(OB)基因在松辽黑猪标记辅助选择中的应用。在CAST基因内含子6存在一个A→G的碱基突变，导致了Hinf I限制性酶切位点的改变，产生多态性片段；OB基因第3469位碱基处存在一个T→C的碱基突变，导致限制性片段长度多态性的产生。将两个候选基因两个突变位点作为一个分子标记，通过聚合PCR-RFLP的方法，用限制性内切酶Hinf I检测两个突变位点，并将检测结果与松辽黑猪的肉质性状进行关联分析，以期为松辽黑猪的选种、早期选育、杂种优势的利用等提供基础参数，为松辽黑猪改良育种和新品系的培育提供理论依据和实验基础。本发明的特点在于建立CAST基因和OB基因聚合PCR，同时建立两个候选基因同一个限制性内切酶Hinf I聚合酶切方法，为松辽黑猪的标记辅助选择提供实验依据。

主权项

一种CAST基因和OB基因聚合PCR的方法(1)采集松辽黑猪肝脏组织；(2)肝脏组织提取基因组DNA，(3)设计两对特异性引物并进行PCR聚合扩增，所设计一对特异引物为：CAST上游引物：5′-AAAGCCTACCCACGCACT-3′CAST下游引物：5′-GCAGATACACCAGTAACAGAAA-3′OB上游引物：5′-GAGCCAACATCTCTCTCGCTGAG-3′OB下游引物：5′-GACTCCTGGAAGCTCAGGTTTCTTC-3′PCR反应总体系为50μL，其中10×buffer 5.0μL，2.5mM dNTP 4.0μL，10.0pmol/μL的两对上游引物和下游引物各1.0微升，1U Taq DNA聚合酶，20-50纳克基因组DNA，最后用四馏水补足至50微升。循环程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，60.5℃复性45sec，72℃延伸1min，32个循环，72℃终延伸10min。反应结束后，PCR扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。