[发明专利]一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法

摘要

本发明公开了一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法，属于生物技术领域。包括取适合长度的花蕾，进行4℃低温预处理24h，消毒后采用挤压法使小孢子游离，过滤并离心，将纯化的小孢子悬浮在的液体培养基中，32.5℃高温热激处理24h后转移到25℃黑暗培养15-20天；出现肉眼可见的胚状体后，置于光照下培养5～7d至出现子叶型胚状体，待胚状体转绿后接到继代培养基上萌发然后转移到生根培养基上生根，获得完整的再生植株；然后开瓶炼苗，驯化移栽到装有灭菌基质的营养钵中；利用该方法进行培养，获得较高频率的胚状体，所获得的单倍体再生植株既是良好的育种材料，也是进行分子标记和遗传图谱绘制研究、基因克隆和转基因等研究的理想材料。

主权项

一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法，包括以下步骤：1)小孢子培养1.1取材盛花初期取3.1～4.0mm长度的干净无污染花蕾，将花蕾保湿置于4℃处理1～3d；1.2消毒花蕾用体积比75％酒精消毒60s，质量比8％的次氯酸钠溶液表面消毒15min，无菌水冲洗；1.3小孢子分离将消毒后的花蕾加入pH5.8的小孢子游离B5-13培养基，采用挤压法游离小孢子，然后用450目尼龙网过滤，将滤液收集于离心管，1000r·min-1离心5min，弃上清液，再加入小孢子游离培养离心；1.4小孢子培养清洗后的小孢子悬浮在pH6.2的液体培养基1中，调整小孢子密度为1×105～2×105个mL-1，并加入100μL的含有0.5g·L-1琼脂糖和10g·L-1活性炭的水悬浮液，于32.5℃恒温培养箱热激处理24h，再转移到25℃条件下静置黑暗培养15～20天；2)小孢子胚状体的培养和再生植株的获得2.1胚状体的萌发出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床60r·min-1、25℃黑暗培养；胚状体发育到子叶期时转置于光照下静置培养5～7d，待胚转绿后转到继代培养基上培养，经过3-4次继代将无根试管苗转移到生根培养基中生根培养，条件为25℃、5000Lx、16h·d-1；2.2植株再生再生株长到含4～5片叶的健壮苗时，在培养室内开瓶炼苗，驯化移栽到装有灭菌基质的营养钵中，于25℃下12h光照和12h黑暗交替静值培养，1周后营养钵放置外界阴凉处，逐步炼苗，3周后将其移栽到大田，获得植株。