[发明专利]一种诱导捕食线虫真菌同步产生捕食器官的方法

摘要

本发明涉及一种诱导捕食线虫真菌同步产生捕食器官的方法，属于应用微生物学领域。本发明方法包括线虫培养、线虫提取物制备，捕食线虫真菌培养和捕食器官诱导步骤。本发明通过培养线虫(秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans)，利用超声波破碎和离心制备线虫提取物，利用线虫提取物诱导捕食线虫真菌同步产生大量捕食器官(106捕食器官/mg菌丝)。本发明操作简单易行，重复性好，可以获得大量同步的三维菌网，为进一步研究捕食线虫真菌捕食器官形成的分子机制提供了良好的实验材料。

主权项

一种诱导捕食线虫真菌同步产生捕食器官的方法，包括线虫培养、线虫提取物制备，捕食线虫真菌培养和捕食器官诱导步骤，其特征在于本方法具体如下：(1).培养基和线虫的培养a.在250mL三角瓶中加入10g燕麦片，加入30mL去离子水将燕麦片浸润，121℃灭菌20分钟；b.秀丽隐杆线虫的培养：在灭菌的燕麦培养基中加入1mL的线虫悬液，21-26℃培养6-7天，培养好的线虫在4℃保存1周；(2).线虫提取物的制备a.用3层擦镜纸将含有秀丽隐杆线虫的燕麦培养基包好，用贝氏漏斗法过夜收集燕麦培养基培养的线虫；b.将收集到的线虫用M9缓冲液清洗，去除残留的培养基；c.离心收集线虫，4℃，8,000g，离心20分钟；d.用无菌去离子水悬浮线虫，4℃，8,000g，离心20分钟收集线虫；重复3次；最后用无菌去离子水悬浮线虫，10g线虫加入30mL无菌去离子水；e.将线虫悬浮液置于冰水混合物上超声：50％强度，6s ON，3s OFF，10分钟；放置30分钟后，再次超声，6s ON，3s OFF，5分钟；f.12,000g，离心30分钟收集上清液；g.用0.22μm的滤膜过滤上清液，过滤后的上清液即为线虫提取物，分装后存于-80℃待用；(3).捕食线虫真菌的培养a.CMA和PDA培养基CMA培养基：称取20g玉米粉，加入1000mL去离子水，100℃煮沸20分钟，用6层纱布过滤收集液体，加入20g琼脂，121℃灭菌20分钟；PDA培养基：去皮马铃薯200g，切块、煮沸30分钟，6层纱布过滤收集上清液，加入葡萄糖20g，加水补充体积到1000mL，121℃灭菌20分钟；b.捕食线虫真菌的活化和孢子培养在CMA固体培养基上接种捕食线虫真菌，26℃恒温培养箱内培养10天，以得到大量的孢子，用无菌水冲洗CMA平板上的捕食线虫真菌菌丝；用移液器将平板上的液体转移至装有无菌擦镜纸的漏斗内过滤，收集孢子；用血球计数板计数并的计算孢子的浓度；c.捕食线虫真菌的液体培养和新鲜菌丝的收集制备PDA液体培养基，分装于500mL的三角瓶内，200mL培养基/瓶，在液体培养基内接种孢子，100个孢子/mL液体培养基，摇床培养：26℃，160rpm，5-6天，用无菌的6层纱布过滤收集菌丝，并用无菌去离子水冲洗菌丝3-4遍，去除培养基成份，用40mL无菌去离子水悬浮菌丝，用于三维菌网的液体诱导；(4).捕食线虫真菌捕食器官的诱导将收集得到的捕食线虫真菌新鲜菌丝用无菌去离子水悬浮后，在三维菌网诱导实验组内加入线虫提取物，加入量为1∶10，v/v；在营养菌丝对照组内加入等体积的无菌去离子水；将平皿静置于26℃恒温培养箱内孵育24-48h，大量的捕食器官三维菌网产生；诱导结束后，用无菌的4层纱布分别过滤收集对照组和实验组的菌丝，并用无菌去离子水冲洗菌丝3-4遍；用无菌滤纸去除菌丝内的水分；菌丝用液氮冻干后，存于-80℃待用。