[发明专利]一种在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法

摘要

本发明公开了一种在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法，是利用基因工程手段将成骨蛋白编码基因连接到油体蛋白基因的3’端，构建由油体蛋白启动子驱动的“油体蛋白-肠肽酶-人成骨蛋白”植物表达载体，转化花生，重组蛋白伴随着油体的积累在花生种子中高水平的表达，通过漂浮离心将重组蛋白分离纯化，然后通过外切蛋白酶消化后纯化获得该蛋白。本发明方法获得的重组蛋白安全、活性高、非常容易回收和纯化，而且可以在花生种子中长期的储存、运输方便，可以增加农产品的附加值。

主权项

1.一种在花生种子中表达人成骨蛋白-1的方法，步骤包括(1)克隆包含特异启动子的大豆全长油体蛋白基因soy-oleosin；(2)人成骨蛋白成熟肽cDNA基因bmp7的获得；(3)构建植物表达载体pCAMBIA1302-bmp7；(4)植株转化；(5)转基因花生种子的获得；(6)Western Blot检测转基因花生种子中人成骨蛋白的表达；(7)从转基因花生种子中大规模分离并回收人成骨蛋白；其特征是：所述克隆包含特异启动子的大豆全长油体蛋白基因soy-oleosin的方法是：以大豆基因组DNA为模板，以primer1：5’CATGCCATGGTGTTTATCTTTCTTGCTTTTCTG 3’；primer2：5’CCGGAATTCCCTTATCATCATCATCTGCGGTTGCGGTTGTTGCTGTCA 3’为引物进行PCR反应，PCR反应程序是：94℃5min；再94℃50s，54℃45s，72℃2min，30循环；72℃7min；所述人成骨蛋白成熟肽cDNA基因bmp7获得的方法是：以人软骨细胞的mRNA为模板，以primer3：5’CCGAATTCATATGACCGGCAGCAAACAG 3’；primer4：5’GAAAGCTTGATCCTTACATGTCGCAGCCACAGGC 3’为引物进行一步法RT-PCR反应，PCR反应程序是：45℃1h；再45℃5min，51℃1min，72℃1min，30循环；72℃7min；所述植物表达载体pCAMBIA1302-bmp7的构建方法是：通过一个肠肽酶位点将bmp7基因连接到soy-oleosin基因的3’端，再通过NcoI和HindIII特异位点一起构建入植物表达载体pCAMBIA1302中，获得pCAMBIA1302-bmp7植物表达载体；所述的植株转化是：将带有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1302-bmp7通过农杆菌侵染的方法转化花生植株；所述花生种子获得的方法是：收获第二代的转基因花生纯合体的花生种子；所述Western Blot检测转基因花生种子中人成骨蛋白的表达的方法是：用人成骨蛋白抗体作为一抗，辣根过氧化物酶作为二抗的免疫印迹杂交检测；所述从转基因花生种子中大规模分离并回收人成骨蛋白的方法是指：将获得的花生种子粉碎，液体抽提，离心处理，回收上层油相，得到融合蛋白；融合蛋白经酶切后离心即获得人成骨蛋白。