[发明专利]褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法，它是以褐点石斑鱼心脏组织为材料，采用胰蛋白酶消化法启动原代培养，在含胎牛血清、碱性成纤维样细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、硫酸软骨素和对数期褐点石斑鱼鳍细胞培养上清液的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；由本发明构建的褐点石斑鱼心脏细胞系，目前已传至第70代，其工艺科学合理，可望应用于鱼类病毒的分离、繁殖、病毒疫苗制备，以及病毒与宿主细胞相互作用等方面研究；还可作为环境毒理学研究环境污染物的模型，对海洋中存在的各种环境污染物，包括基因毒物、诱变剂、致癌物、环境激素和内分泌干扰物等，进行污染监测和安全性评价。

主权项

1、一种褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法，首先对鲜活褐点石斑鱼用浓度均为1000单位/毫升的青霉素和链霉素的高双抗海水消毒处理24小时，以75％酒精再次消毒，置于超净工作台中解剖取下心脏组织，磷酸盐缓冲液漂洗后剪成大致1mm3的组织块；用浓度为0.125％～0.25％的胰蛋白酶对心脏组织块消化5-10分钟，并离心收集心脏组织块；将该心脏组织块用含有5％胎牛血清和0.25‰～1‰硫酸软骨素的pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液充分悬浮，并均匀接种于多个25毫升培养瓶中，在22～24℃下正置干贴16～20小时后，每瓶加入5毫升褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液，置22～24℃生化培养箱中培养，每隔3～5天吸出2.5毫升上述25毫升培养瓶中的培养液，再添加2.5毫升上述褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液；待褐点石斑鱼心脏细胞长成单层后，再使用浓度为0.0625％～0.125％胰蛋白酶溶液消化，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；所述的褐点石斑鱼心脏细胞专用增殖培养液配方为含有20％胎牛血清和0.25‰～1‰比例的硫酸软骨素、pH值为7.0～7.4的DMEM/F12培养液。