[发明专利]一种用于生物靶细胞药物敏感性试验细胞的培养方法

摘要

本发明公开了一种用于生物靶细胞药物敏感性试验细胞的培养方法，通过外周血淋巴细胞制备，组织细胞制备，细胞培养，细胞标记等步骤，将培养后的细胞收集到流式细胞仪样品管中，通过流式细胞仪测定特定靶细胞的百分率，计算出各种药物对靶细胞的作用，选择出对患者最有效的药物。可检测的生物靶细胞包括：总T细胞，总B细胞，辅助性T细胞，抑制性T细胞，NK细胞，γδT细胞，T调节性细胞，αβT细胞，肿瘤细胞，肿瘤干细胞，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ，TNF-α的细胞。通过本发明可以精确为细胞功能异常者选择出最有效的治疗药物，显著提高治疗疗效和减少无效治疗，减少患者身体的伤害和经济的损失，为国家和患者节约大量医疗成本。

主权项

1、一种用于生物靶细胞药物敏感性试验细胞的培养方法，其特征是：由以下步骤组成：(1)外周血淋巴细胞制备，采取患者外周静脉血3～5毫升，抗凝，用磷酸盐缓冲液等体积稀释，将稀释后的血液加在含有淋巴细胞分离液离心管内的淋巴细胞分离液表面，2000转/分，离心20分钟，吸出淋巴细胞于另一离心管，加入5～10mL磷酸盐缓冲液混匀，1500转/分，离心15分钟，弃上清液，再加入5～10mL磷酸盐缓冲液混匀，计数后，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，细胞用细胞培养液稀释成1×106/毫升细胞悬液，备用；组织细胞制备：将新鲜手术组织用常规组织细胞分离方法，分离为单细胞悬液，用细胞培养液稀释成1×106/毫升细胞悬液，备用；(2)含各种待测药物培养基制备：将各种待测药物用细胞培养液配制成2倍临床常规使用剂量峰值浓度的药液，备用；(3)细胞培养：将含各种待测药物培养液加入96孔培养板，每孔100微升，每个药加2孔，设空白对照孔，不含任何药物的细胞培养液，将制备好的患者细胞悬液加入上述培养孔中，每孔100微升，震荡混匀，置37℃，5％CO2环境中保湿培养3-7天；(4)细胞标记：将培养后的细胞收集到流式细胞仪样品管中，每一种药物分别收集到一管中，加入2mL磷酸盐缓冲液混匀，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，细胞沉淀中加入100μL磷酸盐缓冲液，混匀，再加入荧光标记的各种的单克隆抗体室温下，18～22℃，避光放置20～30分钟，加入2mL磷酸盐缓冲液混匀，1000转/分，离心10分钟，弃上清液，加入0.3～0.5毫升磷酸盐缓冲液，混匀，待测；流式细胞仪测定：按照流式细胞仪常规操作，检测特定靶细胞的百分率，计算各种药物对靶细胞的增殖或抑制或细胞毒作用，细胞因子采用细胞培养上清液检测，流式细胞仪测定分泌细胞因子含量，选择出对患者最有效的药物；其中，可检测的生物靶细胞包括：总T细胞，总B细胞，辅助性T细胞，抑制性T细胞，NK细胞，γδT细胞，T调节性细胞，αβT细胞，肿瘤细胞，肿瘤干细胞，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ，TNF-α的细胞。