[发明专利]沙冬青叶片抗冻蛋白的提取分离方法

摘要

本发明涉及一种沙冬青叶片抗冻蛋白的提取分离方法，该方法是由采样、研磨、提取沙冬青叶片总蛋白、离子交换层析初步分离抗冻蛋白、凝胶过滤系统再次分离抗冻蛋白及脱盐步骤完成。通过该方法，成功地提取分离出了吐鲁番沙漠植物园中引种栽培的新疆沙冬青叶片中的抗冻蛋白，为进一步纯化新疆沙冬青的抗冻蛋白并研究抗冻蛋白的结构、功能与调控机制奠定了有价值的前期工作，也为植物抗冻蛋白的提取、分离补充了新的实验资料。

主权项

1、一种沙冬青叶片抗冻蛋白的提取分离方法，其特征在于按下列步骤进行：a、采样采集成株沙冬青叶片迅速放入液氮中运回，保存于超低温冰箱备用；b、研磨将沙冬青叶片，用200-300ml液氮充分研磨至粉状，颜色呈灰绿色，保持低温；c、提取沙冬青叶片总蛋白将5-50mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.05-1mol/L氯化钠、0.05-1mmol/L乙二胺四乙酸和0.5-10mmol/L苯甲基磺酰氟混合，用0.1-1mol/L三羟甲基氨基甲烷调整该混合液的pH值为7.2-10，搅拌均匀，加于步骤b粉末中，充分搅拌混匀，离心，温度1-15℃，转速10000-15000，时间10-30min，取上清，上清液即为总蛋白提取液；d、离子交换层析初步分离抗冻蛋白将5-100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1-1mol/L氯化钠和0.1-1mmol/L乙二胺四乙酸的混合液，用0.1-1mol/L三羟甲基氨基甲烷调整该混合液的pH值为7.2-10，平衡DE-52离子交换柱，以0.5-5ml/min的流速平衡处理总蛋白提取液，再用10-100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，10-100mmol/L三羟甲基氨基甲烷，0.1-10mol/L氯化钠分别同时进行洗脱，收集各个洗脱峰，冷冻干燥呈粉末状；e、凝胶过滤系统再次分离抗冻蛋白将干燥的蛋白粉末用1-50μl双蒸水溶解后，采用pH7.2-10，10-100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐平衡S300凝胶过滤柱，以0.5-5ml/min的流速再次平衡处理经双蒸水溶解后的蛋白粉末溶液，然后再用pH7.2-10，10-100mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐进行洗脱，收集各个洗脱峰，冷冻干燥呈粉末状；f、脱盐将干燥的蛋白粉末用1-50μl双蒸水溶解，采用双蒸水平衡G-25凝胶过滤柱，缓慢加入用双蒸水溶解的蛋白粉末，再用50-100ml双蒸水洗脱，收集洗脱峰，将洗脱峰冷冻干燥呈粉末状，抗冻蛋白即呈干燥粉末状。