[发明专利]一种洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法

摘要

本发明涉及一种洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，属植物病毒保存技术领域，包括如下步骤：病毒病原种类的鉴定、培养基的配制、脱毒组培鳞茎的培养、病毒ELISA检测、病毒摩擦接种、病毒的鳞茎保存。本发明的优点是：利用洋水仙脱毒组培鳞茎感染提纯病毒，再进行洋水仙组培鳞茎保存病毒，克服了传统保存的不足，可防止病毒混杂与丢失，且易提取制备高滴度病毒，为抗病毒育种和病毒检测抗血清制备中提供高纯度的病毒，降低了保存成本并提高了保存效果，并便于携带交流。

主权项

1.一种洋水仙病毒的组培鳞茎保存方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：1)、洋水仙病毒病原种类的鉴定：2)、培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：(1)基本培养基：选用MS培养基，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；(2)子鳞茎诱导培养基：MS+BA 0.1～1mg/L和NAA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖30g/L；(3)子鳞茎增殖培养基：MS+BA 0.05～0.5mg/L和NAA 0.1～1mg/L+蔗糖或白糖40g/L；(4)子鳞茎保存培养基：1/2MS+BA 0.01～0.1mg/L和NAA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L；(5)鳞茎生长培养基：MS+BA 0.01～0.1mg/L和NAA 0.05～0.5mg/L+蔗糖或白糖40g/L；(6)生根培养基：1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L+蔗糖或白糖20g/L；3)、洋水仙脱毒组培鳞茎的培养，按如下步骤进行：(1)鳞茎低温处理：鳞茎经8℃低温处理2～4周；(2)鳞茎萌芽：将步骤(1)低温处理过的鳞茎放在25℃培养室内培养1～2周，使鳞茎快速萌芽；(3)外植体的选取与灭菌：取步骤(2)3～5cm的新芽为外植体，经灭菌处理，作为脱毒组培用的外植体；(4)茎尖培养：将步骤(3)灭菌处理后的幼芽在无菌条件下，在40倍的双筒解剖镜下，摘出0.2～0.3mm大小的带1～2个叶原基的茎尖，接种在子鳞茎诱导培养基上，经1～2个月后，从茎尖诱导形成幼芽或子鳞茎；(5)子鳞茎增殖培养：将步骤(4)诱导形成的幼芽或子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天增殖出子鳞茎；每隔30～45天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天再增殖出子鳞茎；(6)子鳞茎生长培养：将步骤(5)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养30～45天使鳞茎长大到0.5～1cm；(7)生根培养：将步骤(6)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，20～30天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(8)移栽：当步骤(7)的生根子鳞茎苗高生长至3～5cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养1～2个月至成苗；(9)定植：将步骤(8)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养6～10个月至植株；4)、病毒ELISA检测：应用病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达，以获得大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备病毒特异性抗血清，对步骤3)的洋水仙植株进行病毒ELISA检测；5)、病毒摩擦接种：按照裘维蕃的方法，将步骤1)分离纯化的病毒通过汁液摩擦接种到步骤4)检测为无病毒的洋水仙植株上；6)、病毒的鳞茎保存：将步骤5)接种上病毒的洋水仙进行组培鳞茎的培养和保存，按如下步骤进行：(1)鳞茎低温处理：鳞茎经8℃低温处理2～4周；(2)鳞茎萌芽：将步骤(1)低温处理过的鳞茎放在25℃培养室内培养1～2周，使鳞茎快速萌芽；(3)外植体的选取与灭菌：取步骤(2)3～5cm的新芽为外植体，经灭菌处理，作为组培用的外植体；(4)幼芽培养：将步骤(3)灭菌处理后的幼芽在无菌条件下，接种在子鳞茎诱导培养基上，经1～2个月后，诱导形成子鳞茎；(5)子鳞茎增殖培养：将步骤(4)诱导形成的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天增殖出子鳞茎；每隔30～45天，将增殖的子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，培养30～45天再增殖出子鳞茎；(6)子鳞茎保存：将步骤(5)增殖的子鳞茎转接到子鳞茎保存培养基上，子鳞茎生长缓慢，保存培养10～12个月，鳞茎长大到0.5～1cm；(7)子鳞茎生长培养：将步骤(6)保存的子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，培养30～45天使鳞茎长出叶片；(8)生根培养：将步骤(7)长大的子鳞茎接种在生根培养基中进行生根培养，20～30天后，子鳞茎上部长出叶片，子鳞茎基部长出数根根系；(9)移栽：当步骤(8)的生根子鳞茎苗高生长至3～5cm以上、根长出5根以上时，移栽基质培养1～2个月至成苗；(10)定植：将步骤(9)的移栽苗定植在温室内的盆钵中，培养6～10个月至植株。