[发明专利]一种草茎点霉的遗传转化方法

摘要

本发明提供了一种利用电穿孔(electroporation)技术对草茎点霉(Phoma herbarum)进行外源基因的遗传转化方法：利用真菌细胞壁降解酶对草茎点霉的细胞壁进行处理，得到原生质体并进行纯化，纯化的原生质体和适量外源基因/脱氧核糖核酸(DNA)水溶液进行混合，然后利用电穿孔仪对混合液进行电击处理，电击处理的原生质体可以吸纳外源DNA，从而实现了外源DNA对草茎点霉的遗传转化。本发明的有益效果体现在：可以用来对草茎点霉实施基因工程从而进行遗传改良育种，可以用于旨在提高抗肿瘤多糖YCP和其它活性化合物的生物合成能力的转基因育种；也可以用于草茎点霉的分子生物学研究，如研究该菌对植物和鱼类的致病分子机制以及该菌的生长发育等。

主权项

1. 一种草茎点霉的遗传转化方法，其特征是它由下列步骤组成：(1)将草茎点霉原生质体用缓冲液EB悬浮，以显微镜检查计数，调整原生质体液的原生质体浓度至107-108/ml，所述的缓冲液EB为一种水溶液，其中含：浓度为2mM的2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸，pH7.5，浓度为0.6M的甘露醇，浓度为1mM的MgCl2，在121℃高压灭菌20min，(2)将用于转化的外源DNA溶于无菌去离子水至终浓度为1μg/μl，每100μl原生质体液中加入5μgDNA，混匀，冰浴冷却20min，成混合液，所述的外源DNA为任何可以转化真菌的DNA或质粒，(3)在预冷的电击杯中加入步骤(2)所得混合液，冰浴冷却5min后用电穿孔仪进行电击，(4)电击后向电击杯中加入1ml添加甘露醇至终浓度为0.6M的甘露醇的CM液体培养基，冰浴冷却20min，悬浮后与5ml融化的0.7％CM固体培养基混合，平铺于添加蔗糖至终浓度为0.2M的1.5％CM固体培养基平板上，28℃培养12h后，覆盖10ml融化的0.7％CM固体培养基，其中添加潮霉素至终浓度为250μg/ml的潮霉素，在28℃培养至转化子出现，所述的CM液体培养基的配方为：3％蔗糖，0.3％硝酸钠，1％磷酸钾，pH5.8，0.05％KCl，0.05％MgSO4，0.001％FeSO4，0.2％酵母提取物，121℃高压灭菌20min；所述的0.7％CM固体培养基的配方为：CM液体培养基中加入终浓度为0.7％的琼脂粉，121℃高压灭菌20min；所述的1.5％CM固体培养基的配方为：CM液体培养基中加入终浓度为1.5％的琼脂粉，121℃高压灭菌20min，(5)将转化子在添加终浓度为125μg/ml的由外源DNA所编码的抗生素的1.5％CM固体培养基平板上继代培养，稳定生长后保存，所述的外源DNA编码的抗生素优选潮霉素。