[发明专利]大引物PCR进行定点突变的方法

摘要

本发明提供一种大引物PCR进行定点突变的方法。首先由突变引物和相应的外侧引物进行第一步PCR，其产物即大引物不需纯化，与加入另一外侧引物引发第二轮PCR扩增出目标片段。本发明克服了常规大引物和外侧引物退火温度(Tm)相差显著的要求，并使突变效率达到100％，适合实验室分子生物学手段研究。

主权项

1.一种大引物PCR进行定点突变的方法，其特征在于包括的步骤：设计的正反向引物不受退火温度差距大的要求的限制，长度为24-39bp，优选长度27-34bp，5’端根据原模板需要引入各种酶切位点，3’端与模板互补，互补的碱基数为9-14bp，优选碱基数为9bp；根据要突变的碱基所处序列的位置设计突变引物，包括：要突变原始序列的后部分的碱基，则突变引物要与下游引物相对应，二者引发第一轮PCR反应；要突变原始序列前半部分的碱基，则应与上游引物相对应，二者引发第二轮PCR反应；将需要突变的碱基替换成期望突变后的碱基，并在其位点前后各延伸12bp，实现定点突变；突变引物的退火温度要高于正反向引物，具体的步骤：1)首先由突变引物和其对应的外侧引物引发第一轮PCR反应，扩增出含突变碱基的基因片段，实现大片段的合成，即大引物；2)产物不需纯化，直接在同一反应管中加入另一外侧引物、四种脱氧核糖核苷酸和DNA聚合酶，引发第二轮PCR反应，实现目标片段的合成；两条外侧引物和突变引物的退火温度相差10-16℃。