[发明专利]重组豌豆白蛋白亚组分PA1b基因的异源表达方法

摘要

本发明提供了一种重组豌豆白蛋白亚组分PA1b基因的异源表达方法，该方法包括：目的基因PA1b的合成：重组质粒pPICZαA－PA1b转化宿主菌大肠杆菌；转化宿主菌毕赤酵母菌GS115，构建表达PA1b的基因工程菌；PA1b基因工程菌的发酵培养。本发明采用DNA体外重组的方法，构建出了能够表达PA1b的基因工程菌，实现了PA1b基因的异源表达，通过液体深层发酵密集培养的方式来批量获得目的产物，首次实现了植物活性多肽豌豆PA1b资源的规模化生产。本发明工艺简便，成本低，产量高，重组蛋白获得率约为20mg/L。

主权项

1、一种重组豌豆白蛋白亚组分PA1b基因的异源表达方法，其特征在于包括如下步骤：(1)目的基因PA1b的合成；双酶切PA1b基因与载体，构建重组的表达载体：以豌豆cDNA文库为模板，以上游引物、下游引物进行RT-PCR扩增获得PA1b基因片段；扩增PA1b基因片段用Mini-preperation Kit纯化，并用内切酶Xho I和Not I双酶切，酶切片段经纯化后，通过连接酶连接入pPICZαA载体上，构建表达产物的重组质粒pPICZαA-PA1b；所述上游引物Xho I-PA-F：5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTT CTTGCA ACG GTG TTTG-3′；所述下游引物Not I-PA-R：5′-GAT CTC AGT GGT GGT GGT GG-3′；(2)重组质粒pPICZαA-PA1b转化宿主菌大肠杆菌E.coli Top 10；步骤(1)获得的重组质粒pPICZαA-PA1b采用电转化的方式导入大肠杆菌E.coli Top 10中，菌体在含抗生素Zeocin的LB培养基平板上培养，筛选转化菌；再将阳性转化菌株接种到含抗生素Zeocin的LB液体培养基中，进行扩大培养；过夜后离心收集细胞，提取重组质粒pPICZαA-PA1b；(3)重组质粒pPICZαA-PA1b转化宿主菌毕赤酵母菌GS115，构建表达PA1b的基因工程菌：将步骤(2)获得的表达重组蛋白基因的质粒pPICZαA-PA1b先用Sal I处理成线状后，采用电转化的方法将其导入毕赤酵母细胞；然后涂布在含抗生素Zeocin的YPD培养基中，涂布量分别为10～200μl；或者采用快速直接筛选多拷贝数的重组体的方法将转化子涂布在高Zeocin含量的YPD培养基中，筛选转化菌；(4)PA1b基因工程菌的发酵培养：第一步，富集菌体：从步骤(3)获得的Zeocin抗性菌落接种到MGYH培养基中，在25～30℃下，振动培养至A600为2.6；室温下，发酵液低速离心移去上清液，收集细胞；第二步，诱导重组蛋白表达：将上一步收集的细胞用BMMH培养基重新悬浮细胞至A600为0.1，进行培养，诱导抗虫蛋白表达；每24h添加100％甲醇至终浓度为0.5％，维持诱导压力，促使重组蛋白表达；(5)表达产物的分离纯化：经甲醇诱导重组蛋白表达的发酵液离心除去细胞后，上清液采用Ultrafree-15超滤膜分离；滤液进一步用HPLC分离，收集组分真空冷冻干燥，得到异源表达生产的豌豆白蛋白亚组分PA1b。