[发明专利]甲羟孕酮醋酸酯特异性抗体的制备及该抗体用于同源或异源酶联免疫分析的方法

摘要

甲羟孕酮醋酸酯特异性抗体的制备及该抗体用于同源或异源酶联免疫分析的方法，属于酶联免疫分析技术领域。本发明制备了半抗原3－羧甲基肟基－6－甲基－17α－羟基－孕甾－20－酮醋酸酯(3－CMO－MPA)、3－羧甲基肟基－6－氯－17α－羟基－孕甾－6－烯－20－酮醋酸酯(3－CMO－CMA)或3－羧甲基肟基－6－甲基－17α－羟基－孕甾－6－烯－20－酮醋酸酯(3－CMO－MEGA)。将半抗原3－CMO－MPA与蛋白质偶联，制备免疫抗原；将半抗原3－CMO－MPA、3－CMO－CMA或3－CMO－MEGA与蛋白质偶联，制备三种包被抗原。将免疫抗原免疫动物，产生的抗体能与甲羟孕酮醋酸酯发生特异性的反应，用该抗体建立的同源或异源酶联免疫分析方法可快速、灵敏的检测样本中的甲羟孕酮醋酸酯含量。

主权项

1、一种甲羟孕酮醋酸酯特异性抗体的制备方法，其特征在于：1)人工半抗原的合成：以甲羟孕酮醋酸酯、氯地孕酮醋酸酯或甲地孕酮醋酸酯为原料，其与羧甲基氧胺盐酸盐的投料摩尔比为1∶1.2～1∶1.5，在甲醇中溶解甲羟孕酮醋酸酯、氯地孕酮醋酸酯或甲地孕酮醋酸酯，然后将羧甲基氧胺盐酸盐和适量的乙酸钠溶于其中，使pH为5～7，室温下搅拌24小时，减压蒸馏去除甲醇后，用乙酸乙酯萃取残余物，经Na2SO4干燥，过滤，蒸馏去除乙酸乙酯，干燥得到白色固体为3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羟基-孕甾-20-酮醋酸酯(3-CMO-MPA)、3-羧甲基肟基-6-氯-17α-羟基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-CMA)或3-羧甲基肟基-6-甲基-17α-羟基-孕甾-6-烯-20-酮醋酸酯(3-CMO-MEGA)；2)人工抗原的合成：a免疫原的合成与纯化免疫原采用碳二亚胺法合成，将50μmol半抗原3-CMO-MPA加入到1mL的N，N-二甲基甲酰胺中溶解，加入50μmol的二环己基碳二亚胺和50μmol的N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应过夜，离心，取上清溶液100～800μl缓慢加入到4mL10mg/mL的牛血清白蛋白硼酸缓冲溶液中，搅拌反应1小时，然后透析袋中对0.01mol/L磷酸缓冲液透析，分装保存于-20℃；b包被抗原的合成与纯化包被抗原采用混合酸酐法合成，将50μmol半抗原3-CMO-MPA、3-CMO-CMA或3-CMO-MEGA加入到1mL的N，N-二甲基甲酰胺中溶解，加入50μmol的三丁胺和50μmol氯甲酸异丁酯，4℃下反应1小时，将反应液加入到10～20mg/mL的卵清蛋白碳酸缓冲溶液中，搅拌反应2小时，然后透析袋中对0.01mol/L磷酸缓冲液和纯水透析，分装保存于-40℃；3)抗体的制备：a免疫动物血清的制备：选用三月龄、体重2kg雌性新西兰白兔，将3-CMO-MPA免疫原免疫三只，免疫剂量为0.5～1.5mg免疫原/次·只，初次免疫，免疫原中加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化，直至滴入水中不分散，兔背部皮下多点注射免疫原，3～4周后，进行加强免疫，以后2～3周进行加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂，待血清质量合格后，采用心脏取血法采血，收集在试管中的血液凝固后，然后放置在37℃温箱中半小时，再放到4℃冰箱中过夜，待血块收缩后，5000rpm离心15min，分离出血清；b血清的纯化：采用DEAE阴离子交换树脂纯化法纯化血清，在pH7.2的0.01M PBS缓冲液中平衡树脂，用0.01M PBS缓冲液将血清稀释一倍，按1mL稀释后血清比1mL树脂的比例与树脂混合，4℃吸附1小时，然后装柱，pH7.2的0.01M PBS缓冲液洗脱两倍柱体积后，收集洗脱液，加入洗脱液的等体积甘油，-40℃保存，即为抗体产品。