[发明专利]羊草耐盐体细胞突变体筛选方法

摘要

本发明涉及一种羊草耐盐体细胞突变体筛选方法，属于羊草基因工程和遗传育种领域。包括成熟胚诱导愈伤组织再生，体细胞突变体筛选体系的建立，获得耐盐试管苗。优点在于以羊草成熟种子为外植体，筛选的培养基能够高效诱导羊草成熟胚形成愈伤组织并且能够高效再生；该方法操作简便，效果好，适应性广，利用该方法改良羊草品种具有时间短、效率高等特点，培育一个抗盐碱新品种比常规育种方法能提前3～4年完成。

主权项

1、一种羊草耐盐体细胞突变体筛选方法，包括下列步骤：一、成熟胚诱导愈伤组织再生：a.种子的处理：取充分成熟、结构完整的供试羊草种子，剥去种皮，用赤霉素50-150ppm GA3 处理48小时破除休眠，再用70％乙醇和0.1％升汞消毒处理；b.愈伤组织的诱导和继代：诱导培养基用MS培养基，激素为2，4-D，浓度为2～4mg/L，将消毒处理后的植物种子接种到诱导培养基上，培养7～15天，获得愈伤组织；将愈伤组织接种到继代培养基上培养，10～20天继代一次，继代3-5次，该继代培养基采用MS培养基，激素为2，4-D，浓度为2mg/L；c.愈伤组织的再生：将继代生长良好的愈伤组织接种到分化培养基上，分化培养基：MS+6-BA，浓度为1.0～2.0mg/L；激素为2，4-D，浓度为1.0mg/L；培养温度为26±2℃，每天光照14h，光照强度20001x；将分化出的丛生芽接种到生根培养基上，培养20～40天，该生根培养基为：1/4MS+NAA，1.0～2.0mg/L；二、体细胞突变体筛选体系的建立配置1M的中性盐溶液，含1MNaCl，与MS培养基分别以121℃，20分钟高温灭菌后，按以下比例混合配制含盐培养基；第一次：设9个盐浓度梯度为：含盐量(mmol/L)MS 0 50 100 150 200 250 300 350 400第二次：设8个盐浓度梯度为：含盐量(mmol/L)MS 0 80 100 120 140 160 180 200用已经继代培养3～5代、生长旺盛、状态良好且具有胚性的植物愈伤组织进行耐盐性筛选；首先确定羊草愈伤组织耐盐临界浓度，该临界浓度为在该浓度中，植物愈伤组织成活率为1％～5％，取在MS培养基中继代培养生长状态良好的胚性愈伤组织，分别接种于以上不同盐浓度的含盐培养基中；在26℃温室中进行暗培养，分别于第8天，第16天观察羊草愈伤组织生长情况，按羊草愈伤组织耐盐临界浓度确定的植物愈伤组织成活率为1％～5％，得出：羊草愈伤组织耐盐临界浓度采用180mmol/L，在含盐培养基上，直接从该高于临界浓度的培养基中筛选成活的羊草愈伤组织，相同方法，逐代筛选，共筛选3-4代成活植物愈伤组织；三、获得耐盐试管苗：将筛选出的3-4代成活植物愈伤组织接种到分化培养基、生根培养基上，获得耐盐试管苗，产生种子获得耐盐品种；其中分化培养基为：MS+6-BA，浓度为1.0～2.0mg/L；激素为2，4-D，浓度为1.0mg/L；分化培养温度为26±2℃，每天光照14小时，光照强度20001x；将分化出的丛生芽接种到生根培养基上，培养10～30天，该生根培养基为：l/4MS+NAA；1.0～2.0mg/L。