[发明专利]基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测系统的构建方法

摘要

本发明公开了一种基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测系统的构建方法。本发明首先是单链抗融合蛋白Z186－L－SBP和Z163－L－SBP表达载体的构建，设计上下游引物，双链两端分别为NotI和BamHI限制性酶切位点，连接产物；其次是单链抗体融合蛋白Z163－Fc表达载体的构建。通过夹心ELISA方法筛选用于夹心抗体芯片配对的单链抗体融合蛋白，并在此基础上建立了特异性和灵敏度更高的夹心抗体芯片检测系统，该系统的模式不仅适合朊病毒的检测，还适用于其他疾病的病原检测。

主权项

1、一种基于单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片检测系统的构建方法，该系统包括下列步骤：A、构建三种单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP、Z186-L-SBP和Z163-Fc：首先是单链抗体融合蛋白Z163-L-SBP和Z186-L-SBP表达载体的构建，利用上游引物SBP1 5’ATATAGCGGCCGCTTCGAGCTCAGGAG3’和下游引物SBP2 5’TGACCGGATCCTGGTTCACGTTGACCTT3’扩增N端带Linker的SBP片段，双链两端分别为NotI和BamHI限制性酶切位点，然后双链序列与经NotI和BamHI双酶切的线性化质粒pOPE101-215片段混合，经T4 DNA连接酶于16℃下连接过夜，连接产物为载体pOPE-L-SBP，将筛选到的阳性克隆用NcoI和NotI双酶切进行线性化，与经同样双酶切的pCANTAB5E-Z163和pCANTAB5E-Z186胶回收的产物Z163和Z186，以1∶3的摩尔用T4 DNA连接酶于16℃下连接过夜，连接产物为pOPE-Z163-L-SBP和pOPE-Z186-L-SBP；其次是单链抗体融合蛋白Z163-Fc表达载体的构建，用BamHI和NotI从载体pPICZaFc上切下Fc基因片断，然后和同样双酶切的载体pOPE-215以3∶1的摩尔比连接，用T4 DNA连接酶于16℃条件下连接过夜，连接产物为编码有Fc的pOPE-Fc，然后用NcoI和NotI双酶切pCANTAB5E-Z163，与同样双酶切的载体pOPE-Fc以3∶1的摩尔比连接，用T4 DNA连接酶于16℃条件下连接过夜，连接产物为编码有scFv和Fc的pOPE-Z163-Fc；B、通过夹心ELISA，筛选配对抗体Z186-L-SBP/Z163-Fc和KG9/Z163-L-SBP，两种高特异性和灵敏度的夹心抗体芯片：基于单抗和单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片和基于双单链抗体融合蛋白的夹心抗体芯片，对重组牛朊蛋白检测达1pg/mL，并检测鼠脑中天然朊蛋白。