[发明专利]油菜转基因的方法

摘要

本发明公开了一种油菜转基因的方法。本方法以原位生殖器官(包含花粉管，受精前后的配子和合子)为转基因受体。在对油菜授粉后的花柱和子房进行细胞学观察的基础上，确定了该方法的转化时间。在该时间内，削去柱头，滴加外源DNA溶液，使携带外源基因和草胺膦抗性标记基因的DNA转化生殖细胞，通过生长发育，获得转基因的T1代合子(种子)，在T1代幼苗早期用低浓度的除草剂草胺膦进行喷洒筛选，获得转基因阳性油菜植株。本发明的转基因效率为2～10％，转化通量高，而且成本低廉，工作量小，不存在基因型依赖，不存在转基因植株种子繁殖中的春化和越夏问题，筛选简便，结实率高。

主权项

1、一种油菜转基因的方法，它包括下列步骤：A、外源DNA导入时间，首先是花蕾选择，选择油菜花序，摘除顶部未开放的小花蕾和下部角果及已经开放的花；其次是花粉的准备，选择上述处理的单株的一个分枝花序或在同一品种不同单株上选择花序，从花序上端向下套上硫酸纸袋或油菜自交用的袋子；第三是人工去雄，用浓度为70％的酒精擦拭尖嘴钳和手指尖，剥开第一步中花序的花萼和花瓣露出雄蕊和雌蕊，去除雄蕊，套上硫酸纸袋，下端用回形针别住；第四是人工授粉，打开第二步中所套袋子夹取已处于散粉状态的花药，套上原先的袋子，将取下的花药点在第三步的柱头上授粉；第五是采样，从人工授粉后的0.5小时开始，每隔1小时摘取授粉后的子房，一直到授粉后48小时；第六是子房样品的固定：将不同时期的子房投入FAA固定液中，在1.5毫升的带盖小离心管中室温下固定12～48小时；第七是复水，取出固定后的样品依次投入0.8毫升体积的浓度为60％酒精、45％酒精、20％酒精和蒸馏水四种溶液中各浸泡15分钟；第八是软化，倒掉第七步的蒸馏水，加0.8毫升体积浓度为6mol/L的氢氧化钠淹没样品，处理12小时；第九是染色，倒掉6mol/L的NaOH溶液，在离心管中加入1毫升蒸馏水漂洗5分钟，倒掉蒸馏水，再加1毫升蒸馏水漂洗5分钟，倒掉蒸馏水并吸干水分，在浓度为0.1％苯胺蓝染色液中染色1～6小时；第十是压片，将染色后的子房样品取出，放在已经事先滴加1滴0.1％苯胺蓝染色液的载玻片上，从一侧盖上盖玻片，压盖玻片，压扁柱头、花柱和子房；第十一是荧光显微镜观察，将压片好的玻片放在荧光显微镜的载物台上，在可见光下进行聚焦，直到显微镜中能清晰的看到柱头、花柱和子房；B、外源DNA质粒的抽提和酶切：首先是吸取500微升带有质粒pGreen0229的大肠杆菌DH5α菌液，接入盛有500毫升LB培养基的三角瓶中，37℃恒温摇床上培养，转速200转每分钟，培养16小时，培养基变得浑浊；其次是质粒pGreen0229的抽提，将上一步中变浑浊的培养基分装到离心管中，4℃下8000转/分钟离心5分钟，倒掉上清液收集菌体；然后用SDS-碱裂解法抽提菌液中的质粒DNA.在离心管中加入200微升溶液I，室温下在涡旋仪上蜗旋直到菌体散开，接着在室温下加入400微升溶液II，颠倒离心管混匀，待溶液变得清亮后加入预先冰冷的300微升溶液III，颠倒混匀，放在碎冰中，0℃放置3～5分钟，再将离心管在4℃下10,000转/分钟离心10分钟，吸取上清液于离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇24∶1，颠倒离心管混匀溶液，室温下放置5分钟，然后室温下离心15分钟，转速10,000转/分钟，吸取上清液于离心管中，加入600微升异丙醇，颠倒混匀溶液，室温下离心15分钟，转速10,000转/分钟，倒掉上清液，用250微升50TE溶液溶解质粒沉淀并在水浴锅中37℃水浴1小时，最后加入625微升无水乙醇和25微升3mol/L乙酸钠溶液，颠倒混匀溶液，室温放置5分钟，将质粒再沉淀，室温下离心5分钟，转速10,000转/分钟，倒掉上清液，加入1毫升浓度为70％的酒精，上下颠倒10～15次，室温下离心2分钟，转速10,000转/分钟，倒掉上清液，室温下放置15分钟使酒精挥发，将再沉淀的质粒溶解于250微升SSC溶液中；第三是质粒溶液的电泳检测和定量：在浓度为0.8％的琼脂糖胶/1×TAE缓冲液中电泳测定质粒浓度，经过单酶切/Bgl II和双酶切/Bgl II+BspHI的质粒片段在浓度为1％的琼脂糖胶/1×TAE缓冲液中电泳测定，其步骤是：a.琼脂糖凝胶的制备：0.8％或1％的琼脂糖/1×TAE缓冲液置于三角瓶中，瓶口倒扣一个烧杯，将三角瓶置于微波炉加热5分钟至琼脂糖溶解；b.胶板的制备：取有机玻璃内槽，洗净、晾干，取纸胶条，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，倒入冷却至65℃的琼脂糖凝胶液，使胶液地展开直到在有机玻璃板表面形成均匀的胶层，室温下静置30分钟，待凝固完全后，拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔；c.加样：用微量加样器将质粒溶液或其酶切产物样品各2微升，事先与1微升6×上样缓冲液混溶分别加入胶板的样品孔内，每加完一个样品，换一个吸头，样品孔容量15～20微升，在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5微升的分子量标记/浓度为50ng/ul；d.电泳：加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；在80～100V的电压下电泳；当上样缓冲液中的溴酚兰移动到距离胶板下沿1厘米处停止电泳，将凝胶放入溴化乙锭工作液/0.5ug/ml中染色20分钟，电场强度不高于5V/cm；e.观察与拍照：在紫外灯/310nm波长下观察染色后的凝胶；f.用SSC溶液调整质粒浓度，4℃冷藏质粒溶液备用；C、油菜的转化：油菜播种于田间或人工生长室中，按照正常的栽培管理措施，在开花期，选择天气，人工剥蕾去雄，打掉花序的顶端小花蕾，去掉角果和已经开放的花朵，留下待开放花蕾，每花序留10～15个，套上袋，同时选取另外的花序，打掉已开放的花朵，套袋，为次日授粉提供开放的花朵和散粉的雄蕊，次日，从套袋后开放的花朵上取花粉，授在人工剥蕾后的柱头上，油菜授粉后套袋，在转化和套袋5～14天后取下袋子，待角果成熟后收获种子；D、转基因植株筛选：将收获的种子倒在干净的干平皿上，选取未破裂完整的种子并计数，每1000颗种子为一份，同时选取抗除草剂油菜种子为阳性对照种子，未转基因的油菜种子为阴性对照种子；取干净的大平皿，铺上洁净的滤纸，并用双蒸水湿润滤纸，将一份种子均匀分散在滤纸上，在生长箱中以18～25℃，光照16小时，黑暗8小时的条件催芽，出芽后将其点种在装有中性花土的塑料盒中，在催芽后的3～4天、苗的子叶展开，将除草剂均匀喷洒到叶子上，喷施之后用剪刀剪除已经变黄枯萎的幼苗，待绿苗长到3～5片叶后移栽到温室或带土营养钵中。